毒死蜱高效降解菌的分离和基因工程菌的构建

【摘要】采用毒死蜱生产工厂排污口的污泥为研究材料,将污泥按10%的接种量接入无机盐培养基,每7d添加一次毒死蜱,并添加无机盐培养基至体积保持恒定,富集培养。将毒死蜱乳油添加到固体培养基中制备成毒死蜱选择性平板,利用毒死蜱选择性平板从污泥中筛选获得降解菌株,依据在选择性平板水解圈的形成,在7d和35d分别筛选获得菌株G1和X1。研究了这两株降解菌的降解特性,菌株G1和X1都能够高效地降解毒死蜱。在pH值为5-9,温度为22-42℃的条件下,菌株X1和菌株G1都能够有效地降解毒死蜱；pH值和温度的变化影响菌株对毒死蜱的降解,在pH7和42℃条件下菌株降解毒死蜱更快；虽然42℃并不是这两株菌的最适生长温度,但在此温度条件下菌株的降解能力很高。将培养好的菌液按照10%的接种量接入含有毒死蜱的液体无机盐培养基,在37℃、120r/min条件下培养,评价菌株对毒死蜱的降解能力；利用二氯甲烷提取试管中残留的毒死蜱和产生的中间代谢产物3,5,6-三氯-2-吡啶(TCP),研究降解菌对毒死蜱降解的代谢途径,结果显示这两株菌都是将毒死蜱转化为TCP；菌株X1可以在24h内完全降解100mg/1的毒死蜱,即降解毒死蜱及其中间代谢产物TCP,整个降解过程中毒死蜱浓度逐渐下降,而TCP浓度先上升后下降。菌株G1能将毒死蜱转化为TCP,但不能进一步降解TCP。在降解过程中菌株X1和G1细胞浓度都未出现明显的变化。研究了菌株X1对高浓度毒死蜱的降解能力,结果显示在48h内,菌株能够完全降解200-400mg/l的毒死蜱；当试管中毒死蜱浓度为500mg/1时,菌株X1能降解98.4%的毒死蜱；当浓度达到600mg/1的毒死蜱,48h时菌株X1只能降解73.3%的毒死蜱。革兰氏染色结果显示,菌株X1和菌株G1都是革兰氏阴性细菌。利用细菌16SrDNA基因通用引物扩增菌株的16SrDNA基因,将获得的基因序列与典型菌株的16SrDNA基因比对,结果显示：菌株X1与台湾嗜铜菌(Cupriavidustaiwanensis)LMG19424(AF300324)相似性最高,达到98%；菌株G1与微嗜酸寡养单胞菌(Stenotrophomonasacidaminiphila)AMX19(AF273080)具有最高的同源性,达到99%。结合菌株的部分生理生化特性,菌株X1被鉴定为台湾嗜铜菌,而菌株G1被鉴定为微嗜酸寡养单胞菌。利用限制性内切酶Sau3AI随机酶切基因组DNA,将获得的基因组片段与质粒pUC19连接并转化至大肠杆菌中,分别构建菌株G1和菌株X1的基因组文库,在含有农药和抗生素的平板上,分别获得了能够产生水解圈的单克隆。测序结果显示,从菌株X1中获得了一个3217bp的DNA片段,从菌株G1中获得了长4018bp的DNA片段。软件分析这两个DNA片段,结果显示这两个DNA片段都具有多个开放阅读框。将这些阅读框的序列分别提交至NCBI上比对,菌株X中的毒死蜱降解酶基因与有机磷水解酶(ophB)基因相似度高达99%,判断菌株X1能够降解毒死蜱是该基因编码的酶起作用,这是首次发现ophB基因存在于嗜铜菌中并编码毒死蜱降解酶基因；而菌株G1中的毒死蜱降解酶基因与甲基对硫磷降解酶(mpd)基因具有高度同源性,推断mpd基因编码菌株G1的毒死蜱降解酶。分别克隆mpd基因和oph基因,将这两个基因片段插入到原核表达质粒pET28a,构建大肠杆菌表达质粒pETmpd和pEToph。质粒分别被转化到大肠杆菌中诱导表达,其中mpd基因诱导3h表达量最高,SDS-PSGE显示一个大小约30kDa的蛋白被诱导表达,此时大肠杆菌细胞破碎液的酶活(μg毒死蜱/μg蛋白·h)为0.279士0.001,菌株G1的粗提液对毒死蜱的催化活性为0.025土0.002；而oph基因在大肠杆菌中诱导后,通过SDS-PAGE没有观察到明显的特异性蛋白条带,但是细胞破碎液的毒死蜱降解活性为0.035士0.002,菌株X1细胞粗提液的毒死蜱水解活性为0.018士0.001。玫瑰红红球菌是革兰氏阳性菌,该菌能够转化和降解多种环境污染物,烷烃类有机物,也被用于生物脱硫以及有机物的脱氯。利用质粒pNC9501和pBluescriptSK(-)构建大肠杆菌-红球菌穿梭质粒pBST,将mpd基因插入到质粒pBST中,构建得到了含有毒死蜱降解酶基因片段的质粒为pBSTG。本研究优化了玫瑰红红球菌的电转化条件,结果显示细胞培养至OD600值为0.4,制备的感受态细胞转化效率最高；使用不同浓度的甘油制备的感受态细胞的电转化效率明显不同,其中使用5%的甘油制备的感受态细胞的转化效率最高；电场强度也影响电转化的结果,场强为10kV/cm时电转化效率最高,研究中获得的转化效率最高达到8.0×104个转化子／μg质粒DNA。玫瑰红红球菌被作为受体细胞,质粒pBSTG导入玫瑰红红球菌中,得到的玫瑰红红球菌重组菌能够降解毒死蜱,通过在液体无机盐培养基中降解,工程菌在28h能降解50mg/1的毒死蜱。研究了在不同浓度抗生素对红球菌基因工程菌毒死蜱降解活力(μg毒死蜱／μg蛋白·h)的影响。结果显示当不添加抗生素,重组红球菌具有毒死蜱水解酶活性,达到0.028±0.004,而添加抗生素后毒死蜱活性会提高,最高可达0.057±0.007,说明即使在不添加抗生素的情况下构建的玫瑰红红球菌工程菌也能够降解毒死蜱。
【作者】王道胜；
【导师】唐欣昀；
【作者基本信息】安徽农业大学，微生物学，2013，博士
【关键词】毒死蜱降解；台湾嗜铜菌；微嗜酸寡养单胞菌；mpd；oph；玫瑰红红球菌；电转化；

【参考文献】
[1]连莲香.特殊生境真菌的分离、活性筛选和次级代谢产物研究[D].厦门大学,微生物学,2014,硕士.
[2]张玉1,张德伟,周显青.酶催化显色法测定小麦粉中的过氧化钙[J].现代食品科技,2015,05:.
[3]曹健.新型有机硅单体及其聚合物的合成与性能研究[D].杭州师范大学,应用化学,2013,硕士.
[4]余国军.开关磁阻电机dsPIC30F6010A控制系统研究[D].中国矿业大学,电机与电器,2014,硕士.
[5]刘树鑫.电器设备绝缘状态在线监测方法研究[D].沈阳工业大学,电机与电器,2013,博士.
[6]宋伟伟.基于熵理论的财务危机预警模型研究[D].华南理工大学,数量经济学,2014,硕士.
[7]张文娟.山西省高校教师绩效评价体系研究[D].山西财经大学,教育经济与管理,2013,硕士.
[8]秦仁高.利用废弃尾矿再获铜铁资源[J].有色金属(矿山部分).2005(04)
[9]陈程.双链小分子阳离子对活性染料在蚕丝上的促染[D].西南大学,资源纤维学,2014,硕士.
[10]孙敏敏.Backprojection成像多核并行计算系统设计[D].南京大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[11]杨莉莉,王琦.基于数据挖掘的入侵检测取证系统[J].网络安全技术与应用,2005,05:53-55.
[12]李祖欣,王万良,成新民.资源约束网络的优化带宽调度(英文)[J].自动化学报,2009,04:443-448.
[13]伍坚.外资并购上市公司法律问题研究[D].华东政法学院,经济法学,2003,硕士.
[14]冉全生.ZT集团业务市场战略转型研究[D].西南交通大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[15]宋维涛.微波辅助水蒸气扩散萃取复杂样品中农药残留的应用研究[D].吉林大学,分析化学,2013,硕士.
[16]侯红胜,刘卫国.基于混合驱动的无刷直流电机特性研究[J].电气传动,2014,12:3-7.
[17]任哲.射频辐照细胞实验系统研制[D].西安电子科技大学,生物医学工程,2012,硕士.
[18]郝晋林.塔桅结构的设计研究[D].西北工业大学,结构工程,2004,硕士.
[19]韩永健.转型期乡村集体主义建设考察研究[D].天津大学,马克思主义理论,2013,硕士.
[20]李乃永,王林先.基于MATLAB状态流和故障信息网的保护动作分析方法[J].电力系统自动化,2008,13:67-70.
[21]李琳娜.涉及“公共问题”的网络群体性事件研究[D].郑州大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[22]吕潇强.司法职业化背景下的能动司法探析[D].西南政法大学,法学理论,2012,硕士.
[23]王文德.把握自然规律完善基本政策推动山西退耕还林工作健康发展[J].绿色中国.2004(Z1)
[24]徐继前.番茄红素抑制内质网应激保护小鼠心肌细胞缺氧/复氧损伤的机制[D].川北医学院,麻醉学,2014,硕士.
[25]徐桃云.基于DSP的水轮机调速器研究[D].武汉理工大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[26]罗小元,袁园,张玉燕,关新平.具有丢包、通讯约束的非线性时滞网络化控制系统鲁棒故障检测[J].控制与决策,2014,11:2048-2054.
[27]赵兵兵.我国创业板退市制度研究[D].首都经济贸易大学,经济法学,2013,硕士.
[28]欧树朋.A企业质量战略研究[D].西安科技大学,工商管理,2013,硕士.
[29]黄剑雅.运动干预对40-49岁男性HRV及运动中心电图某些指标的影响[D].北京体育大学,运动人体科学,2013,硕士.
[30]秦子娴.长期施肥中性紫色水稻土氮素矿化及氨氧化菌的分子生态学研究[D].西南大学,植物营养学,2014,硕士.
[31]王燕.供应链违约风险的研究[D].河海大学,2005.
[32]尹凤杰,井元伟,岳承君,王涛,潘伟.不确定输入延时网络系统的鲁棒拥塞控制[J].控制与决策,2007,02:198-201.
[33]李松营.陕渑煤田顶底板水害评价与防治对策研究[D].中国矿业大学（北京）,地质工程,2014,博士.
[34]苏培义,杨鹏.网络协议IEEE802.3af在灯光控制网络中的应用[J].演艺设备与科技.2004(05)
[35]刘建.船用曲轴数控内铣机床控制系统设计[D].沈阳理工大学,机械电子工程,2013,硕士.
[36]李智,韩崇昭.混合μ控制器设计算法[J].控制与决策,2001,02:236-238.
[37]丁建波.仿人机器人稳像技术的研究[D].哈尔滨工业大学,计算机科学与技术,2013,硕士.
[38]张卡卡.苯胺—磺酸基苯胺共聚物的制备及其对染料吸附性能的研究[D].郑州大学,2014.
[39]白日华.沥青路面病害检测与养护决策研究[D].吉林大学,2013.
[40]苏丹丹,刘惠玲,王梦梦.施用粪肥蔬菜基地抗生素残留的研究进展[J].环境保护科学,2015,01:117-120.
[41]周宏.概念隐喻在大学英语词汇教学中的实证研究[D].华中科技大学,学科教学,2013,硕士.
[42]马赫迪.英汉交替传译中的结构重组策略[D].苏州大学,翻译（专业学位）,2014,硕士.
[43]肖扬,杜锡钰.有限状态变系数离散系统的稳定性检验[J].自动化学报,1998,04:88-92.
[44]陈端.三辊联合穿轧机工艺分析及液压同步压下系统设计分析[D].太原科技大学,机械设计及理论,2014,硕士.
[45]林友芳,王琨琨,周超,万怀宇,武志昊.基于社交网络的民航旅客偏好建模[J].北京交通大学学报,2014,06:33-39.
[46]张睿.硕士研究生与导师关系的调查与分析[D].苏州大学,高等教育学,2014,硕士.
[47]槐真.基于价格条件VaR的投指期货套利研究[D].北方工业大学,数量经济学,2013,硕士.
[48]张露露,段松,杨学林.双相碳改性硅酸铁锂正极材料研究[A].中国硅酸盐学会混凝土与水泥制品分会.中国固态离子学暨电池材料青年学术论坛——论文摘要集[C].中国硅酸盐学会混凝土与水泥制品分会:,2013:1.
[49]岳帅.利用分子和细胞遗传学技术分析红花品种资源及水稻杂种后代的鉴定[D].中南民族大学,生物化学与分子生物学,2013,硕士.
[50]魏航.新型石墨烯复合材料的制备及其在生物领域中的应用[D].北京化工大学,2012.