酶法合成~(15)NL-苯丙氨酸及苯丙氨酸解氨酶初步纯化的研究

【摘要】15NL-苯丙氨酸(15NL-Phe)稳定、无放射性,使用安全、方便,作为示踪剂,在医学、生物及化工等领域越来越受到重视。迄今为止,只有HadenerA.等报道合成L-phenyl-[2-13C,15N]alanine的研究,产品纯度与收率均低,分别为62.9%和29%。因此,改进15NL-Phe的工艺,获得高纯度、高丰度、高收率的标记产品,对15NL-Phe的扩大生产有非常重要的意义。苯丙氨酸解氨酶既可治疗苯丙酮尿症及癌症,又可固定化用于L-Phe的生产,因此该酶的分离纯化有很大的应用价值。本文基于实验室前阶段的研究成果,对粘红酵母(Rhodotorulaglutinis)苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化肉桂酸和15N氨生成15NL-Phe的反应进行了深入研究,找到一条具应用前景的15NL-Phe生产路线。此外,通过胞内PAL酶的释放及双水相法提取PAL的研究,提出一种胞内PAL酶初步纯化的新方法。研究内容包括如下几部分：在苯丙氨酸解氨酶法产酸反应中,PAL酶活是控制产酸的关键,但PAL易失活,15NL-Phe的产酸能力受到限制,因此寻找稳定PAL酶活的方法对提高产酸能力至关重要。实验考察了酶反应中几种效应物PEG6000、海藻糖、二巯基苏糖醇、D-山梨醇、甘油和戊二醛对PAL酶的稳定作用,发现0.5%PEG6000对PAL酶的稳定作用最显著,比对照酶活提高80.3%。响应面实验发现效应物组合0.62%海藻糖、0.54%聚乙二醇6000和0.31%巯基苏糖醇稳定PAL酶活效果较好,比对照酶活提高92.9%。15NL-Phe合成反应所用的PAL酶受底物肉桂酸的强烈抑制作用,因此缓解或削弱此抑制作用对增大产酸能力尤为重要。实验考察了β-环糊精对此抑制的缓解作用。当体系肉桂酸量因转化而减少时,β-环糊精释放包合的肉桂酸,使更多的肉桂酸参与转化,缓解高浓度肉桂酸对PAL酶的抑制作用,提高产酸能力。向酶反应混合物中添加与肉桂酸摩尔比为0.13的β-环糊精,可使肉桂酸抑制浓度由135mmol/L上升到270mmol/L;肉桂酸浓度为270mmol/L时,产酸能力比未添加β-环糊精的对照高出166.7%。从PAL酶动力学角度分析β-环糊精对酶促反应的影响,发现最大产物生成速率γmax及抑制解离常数Ki均增大,米氏常数Km减小,进一步说明β-环糊精有缓解高浓度肉桂酸对酶抑制的作用,促进反应向产物方向进行。若同时流加肉桂酸,可比未采取这两项措施的对照产酸高出202.0%。反应产物经离心除细胞、酸沉肉桂酸、除杂蛋白后,产物溶液中还有少量铵盐及其它氨基酸和无机盐。HP20大孔吸附树脂可使酸与盐有效分离并脱除非极性色素,吸附洗脱后15NL-Phe树脂分离的总收率为91.2%,NH4+总收率为95.2%。将洗脱液调pH值到等电点附近,70℃下真空旋转蒸发,加无水乙醇并投微量15NL-Phe晶种,室温下自然结晶4h,4℃下继续结晶24h,将结晶过滤、干燥,母液回收再结晶,结晶率为90.2%,晶体纯度大于99%,15NL-Phe产品总收率为71.1%,远高于报道的纯度62.9%和收率29%。以丰度为5.34%的(15NH4)2SO4为氮源,反应获得的15NL-Phe丰度为5.1%(15NH4)2SO4回收率为82.1%,(15NH4)2SO4得到有效回收,降低了生产成本。PAL酶释放的研究发现：超声破碎法好于冷冻法；温和渗透剂甘氨酸与丙氨酸不利于酶的释放；TritonX-100可显著释放PAL酶；先加入TritonX-100渗透6h再超声破碎,蛋白释放率达76.7%,PAL酶收率为70.3%,是单独使用超声破碎的112%和128%。因此,超声破碎与TritonX-100联用是释放粘红酵母胞内PAL酶的有效手段。PEG/无机盐双水相法纯化Rhodotorulaglutinis胞内PAL酶的研究发现：PAL在PEG/无机盐体系的分配受疏水效应、界面电势、排空效应及盐析效应的影响。通过考察PEG分子量、盐及电解质种类及浓度对PAL分配的影响,发现一条两步法纯化PAL的途径,即分别使用11.0%PEG1000/14.0%Na2SO4(pH8.8)和11.0%PEG1000/14.0%Na2SO4/53%Na2CO3(pH8.8)组成的双水相,两步分配后PAL的收率为80.6%,纯化系数为9.3,与传统盐析纯化法收率相当,但纯化系数为后者的3.7倍,因此,PEG1000/Na2SO4双水相两步法为粘红酵母Rhodotorulaglutinis胞内PAL粗酶的纯化提供了一条新途径。
【作者】岳海燕；
【导师】汪文川；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2006，博士
【关键词】Rhodotorulaglutinis；15NL-苯丙氨酸；苯丙氨酸解氨酶；合成；双水相法；

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