整体柱制备及分离性能研究

【摘要】高效液相色谱(HPLC)技术具有快速、高效和高分辨率等特点,广泛应用于生物物质分离。而色谱柱是高效液相色谱分离技术的核心内容,近年来整体柱技术迅速发展,应用于色谱分析和分离中,日益受到人们的重视。本论文合成了甲基丙烯酸酯整体柱,并用多种配基进行修饰,成功的应用于蛋白质和小分子的分离,并对不同配基所修饰整体柱的分离性能做了较为系统的探讨。通过原位聚合的方法,以甲基丙烯酸缩水甘油酯作为单体,二甲基丙烯酸乙二醇酯作为交联剂,偶氮二异丁腈做为引发剂,正庚烷作为致孔剂,在不锈钢柱管中制备整体柱骨架结构。以比表面积和背压为参考,讨论聚合温度,单体和交联剂比例,引发剂浓度和聚合时间对于整体柱骨架结构的影响,并确定单体和交联剂的比例为80：20(v/v),引发剂浓度为1%(W％,相对于单体含量),聚合温度为65℃,聚合时间为12h。骨架结构由大孔构成,平均孔径为1.9μm。其中500nm以上的大孔占整个孔隙率的85%,有利于后续的高分子配基修饰；微孔比例低,对不同分子量的高聚物没有体积排阻作用。整体柱骨架孔隙率为64.5%,比表面积为5.30m2·g-1。采用两种高聚物DEAE-dextran(500kDa)和聚乙烯亚胺(PEI,30kDa)修饰整体柱骨架,制备阴离子交换整体柱,DEAE-dextran和PEI高聚物配基密度分别为9.93μmol·g-1和242.9μmol·g-1。整体柱的吸附性质受高聚物配基影响,随着高聚物配基分子量的增加,介质的吸附容量增加。BSA在DEAE-dextran整体柱和PEI整体柱上的动态吸附容量分别为23.8mg.g-1和41.5mg.g-1,均不随操作流速变化。血红蛋白和卵清蛋白在PEI整体柱上的动态吸附容量分别为17.5mg.g-1和42.1mg.g-1。固载化的DEAE-dextran同时提供强弱阴离子交换配基,而PEI配基仅提供弱阴离子交换基团。离溶菌酶、血红蛋白和牛血清白蛋白均可在两种高聚物配基阴离子交换整体柱上得到快速分离,且柱效不随流速的增加而变化,说明两种整体柱均具备良好的色谱性能,可应用于蛋白质的快速分离。用PEI整体柱从粗酶粉中纯化脂肪酶,可分离出4种同功酶,酶活总收率为52.2%,最大纯化倍数达到4.5。此外,两种整体柱背压相似,比文献报道低4倍。制备双端胺基化聚乙二醇(AT-PEG)并用于制备AT-PEG疏水整体柱,疏水整体柱吸附容量达到6.5mgBSA每克介质。(NH4)2SO4浓度高于0.12M时即可屏蔽AT-PEG配基上胺基引入的离子交换吸附,(NH4)2SO4浓度高于1.7M后BSA以疏水作用在整体柱上完全吸附。AT-PEG整体柱能用于蛋白质的快速分离,在1445ml·min-1的流速下,2.5min内即可分离细胞色素C、RNaseA和溶菌酶。正丁胺修饰的C4整体柱疏水配基密度为2.16mmol每克介质,由于配基密度增加且疏水性增强,C4疏水整体柱对BSA的吸附容量达14.4mg每克介质。控制洗脱时(NH4)2SO4浓度高于0.15M,即可消除BSA和C4整体柱上胺基的离子交换作用,高于1.2M后,BSA因疏水作用而完全被吸附。在C4疏水整体柱上,细胞色素C、RNaseA、溶菌酶和鸡卵清蛋白在3mmin内即可被分离,蛋白质回收率不受操作流速的影响。分离蛋白质时,正辛胺修饰的C8疏水整体柱配基密度不能超过41.5μmol·g-1,洗脱时控制(NH4)2SO4浓度高于0.15M以屏蔽离子交换作用。因为配基密度偏低,整体柱对BSA的吸附容量仅为7.15mg每克介质。疏水性强的蛋白质(如溶菌酶)在该整体柱上的峰展宽相对严重。BSA在三种疏水整体柱上的回收率均大于90%,且动态吸附容量不受操作流速影响。高配基密度的C8疏水整体柱(2.3mmol·g-1)从葛根黄酮中分离葛根素,最大进样浓度能达到35mg粗提物每毫升,且介质在酸性流动相环境中稳定。分离以反相的模式进行,醋酸浓度变化和葛根素保留因子对数值呈线性关系。经紫外光谱和HPLC分析证明,整体柱可分离出纯度较高的葛根素组分。为了阐述整体柱的柱效,论文推导并简化出整体柱分离生物大分子和小分子物质时等板高度的具体表达式。将蛋白质洗脱盐浓度和分配系数关联,求出线性梯度下峰宽压缩因子,得到梯度洗脱条件下等板高度的表达式,并用梯度洗脱的方式测定了离子交换和疏水整体柱的柱效。两种整体柱在高流速下操作,等板高度不随流速的变化而变化,均维持在5μm左右。由于整体柱中对流传质以及孔结构的不均一性,涡流扩散对等板高度起主要贡献。C8疏水整体柱分离于小分子物质(甲苯)的柱效随操作流速的增加而达到稳定值。小分子轴向扩散系数大,对等板高度有一定贡献,因此增加操作流速能减小扩散,提高柱效；相对于生物大分子而言,甲苯涡流扩散也更显著。实验使用制备色谱从葛根黄酮中纯化葛根素,固定相为新型寡聚β-环糊精键合烯丙基活化SepharoseHP介质。用A1203预处理样品,除掉部分杂质,保护色谱介质不受污染。优化后的制备色谱条件如下：流动相7%HAc水溶液,操作流速10ml·min-1。采用稀释的办法降低样品中乙醇浓度至5%,可以消除制备色谱中的指状效应,提高葛根素的分辨率,同时上样量可达300mg黄酮粗品。分段收集后的葛根素流出液旋转蒸干,95%HAc脱色,水作为溶剂进行结晶,得到纯度为97%以上的葛根素晶体。整个工艺中,葛根素的总收率为32.4%。相对文献而言,该方法在保证纯度的同时,显著提高了葛根素的收率。
【作者】王满意；
【导师】谭天伟；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2007，博士
【关键词】整体柱；聚乙烯亚胺；DEAE-dextran；蛋白质；离子交换色谱；疏水色谱；环糊精；葛根素；

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