介孔壁二氧化硅纳米管的制备及其在酶固定化方面的应用

【摘要】过去几十年来,传统的化学法在化学产品合成、产品分离以及众多化学品的检测分析方面得到了较为充分的发展,然而要求高效、安全、绿色环保、节省原料和能源的方法是目前探索的焦点。为满足高效、安全、绿色环保、节省原料和能源的要求,酶法无疑是最具潜力的解决方案。酶催化法具有许多优点,但同时也存在实际应用上的一些问题。例如：酶的提取、分离、纯化；酶脱离其自然环境后的结构不稳定性；酶对操作条件的敏感性等将会缩短酶的使用寿命。最重要的一点是大多数酶是水溶性的,酶溶于水后将污染产品,也难以回收利用。为克服酶在实际应用上的问题,有几种方法被探索,其中酶的固定化是最为成功的。随着固相载体固定化酶在化学合成和工业生产上的成功应用,探索具有特殊结构和优异性能的固相载体成为这一领域的研究热点。同传统的酶固定化载体(有机聚合物和天然大分子)相比较,某些无机载体因其具有大的比表面和独特结构等引起了国内外学者的兴趣。在众多的无机载体中,二氧化硅载体更是独树一帜,其原因在于二氧化硅载体具有良好的生物相容性、机械和化学稳定性以及对有机溶剂和微生物的耐受性。鉴于此,本文采用溶胶-凝胶法,以纳米尺寸针状碳酸钙为无机模板来构筑具有特殊结构的空心二氧化硅纳米管,并将其创新性地应用于生物酶(如：青霉素酰化酶、溶菌酶和葡萄糖氧化酶)的固定化。经研究,我们发现了一些新现象,得到了一些新规律。主要的工作内容和研究结果如下：1、利用本中心自主研发的超重力旋转填料反应床,在最适反应条件下,经炭化法成功制备分散性能良好、平均直径为0.2～0.5μm,平均长径为3.0～5.μm、含88.75%文石相晶体的针状碳酸钙无机模板。2、为了获得优异的载体材料的结构和性能,我们探究了一种以针状碳酸钙为无机模板来构筑介孔壁二氧化硅纳米管的新方法。应用溶胶-凝胶技术和正交优化法,以十六烷基三甲基溴化铵为介孔孔道导向剂,以正硅酸乙酯为有机硅源,成功制备形貌良好的介孔壁二氧化硅纳米管。经正交优化实验得到的最适条件为：反应温度(15-℃)；二氧化硅/碳酸钙的配比(20%)；十六烷基三甲基酰化铵/碳酸钙的配比(50%)。在最适条件下所制备的介孔壁二氧化硅纳米管的介孔孔径为6.5nm左右,壁厚为30-40nm,比表面为749m2/g。3、以针状碳酸钙为无机为模板所制备的介孔壁二氧化硅纳米管用作载体对青霉素酰化酶进行固定化。各种对固定化青霉素酰化酶催化活性的影响因素被考察,如固定化温度和载体/自由酶的配比等。研究结果表明,在最适固定化条件下,青霉素酰化酶在介孔壁二氧化硅纳米管载体上的相对固酶率和酶活性回收率分别达到97.20%和88.80%。使用介孔壁二氧化硅纳米管载体对青霉素酰化酶的固定化还体现了如下方面的优势：可实现对酶的快速固定化、对酸碱和温度有高的耐受性以及良好的操作和储存稳定性等。这些优势充分说明介孔壁二氧化硅纳米管载体在酶的固定化领域将有广阔的应用前景。随后,本研究者对自由/固定化青霉素酰化酶催化水解青霉素钾盐的反应动力学进行了研究。结果表明：自由青霉素酰化酶的米氏常数(Km)和最大反应速度(V)分别为3.23×10-2mol/L、9.3×10-3mol/(L·min);介孔壁二氧化硅纳米管固定化青霉素酰化酶的米氏常数(Km)和最大反应速度(V)分别为6.7×102mol/L、3.7×10-3mol/(L·min)。自由酶的米氏常数小于固定化酶的米氏常数,青霉素酰化酶经介孔壁二氧化硅纳米管固定化后,酶对底物青霉素钾的亲和力降低,酶催化反应速度有所下降。4、为了探究二氧化硅载体的形貌和结构对酶固定化的影响,本研究者选用了三种不同形貌的二氧化硅纳米载体(实心二氧化硅纳米颗粒、空心二氧化硅纳米管和空心二氧化硅纳米球)对溶菌酶实现固定化的比较研究。结果为：溶菌酶在实心二氧化硅纳米颗粒、空心二氧化硅纳米管和空心二氧化硅纳米球上的固酶量分别为186mg/gr二氧化硅)、351mg/g(二氧化硅)和385mg/g(二氧化硅)；固定化酶的催化活性分别为1.08×106unit/g(固定化酶)1.46×106unit/g(固定化酶)和1.38×106unit/g(固定化酶。通过对吸附曲线的比较,发现溶菌酶在实心载体上的固定化过程只经历第一阶段,因酶分子尺寸大于实心二氧化硅纳米颗粒孔径,酶分子不能进入载体内狭小的孔道,没有进行第二阶段的吸附-包埋,而空心载体对溶菌酶的固定化过程可以明确区分为两个阶段,酶分子在外表面吸附为第一阶段,酶分子在孔道内壁面吸附及空腔内包埋为第二阶段,正是由于第二阶段吸附-包埋使得空心-二氧化硅载体的固酶量大大提高。可以看出,作为酶的载体,空心二氧化硅纳米管／球明显要优于实心二氧化硅纳米颗粒。同时,我们也注意到：溶菌酶在空心二氧化硅纳米球上的固酶量要高于在空心二氧化硅纳米管上的固酶量,但是,其固定化酶的催化活性却没有出现同一趋势,这点说明空心二氧化硅纳米球相对封闭结构对酶的固定化起到了双重的作用,一方面能增强载体对酶的固载能力,另一方面却增加了底物和产物的扩散/传质阻力,影响酶分子活性的表达。5、在利用空心二氧化硅纳米管对葡萄糖氧化酶的固定化研究中,我们发现酶的催化活性先是随载体载酶量的增加而提高,随后出现降低的趋势,这点说明：载体对酶的固载量存在一最佳值,这一最佳值可确保酶分子活性得到充分的表达。葡萄糖氧化酶经二氧化硅载体固定化后,酶分子二级结构没有发生变化,载体和酶分子间具有良好的相容性。
【作者】肖清贵；
【导师】陈建峰；
【作者基本信息】北京化工大学，化学工程，2007，博士
【关键词】针状碳酸钙；介孔壁二氧化硅纳米管；青霉素酰化酶；溶茵酶；葡萄糖氧化酶；应用；酶固定化；

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