假丝酵母（Candida sp.）99-125胞外脂肪酶的基因克隆、重组表达以及N-糖基化对脂肪酶功能影响的研究

【摘要】假丝酵母Candidasp.99-125产生的胞外脂肪酶活性高、催化活性强,已经被广泛应用于各种酯类的合成、手性化合物的拆分和生物柴油的合成,是工业生产中重要的催化剂,为了阐明该该酶的基因和蛋白的性质,我们做了如下的工作：1.Candidasp.99-125胞外脂肪酶的分离纯化和性质分析通过丙酮沉淀、Q-sepharose离子交换层析和Butyl-sepharse疏水层析得到了纯化的Candidasp.99-125的胞外脂肪酶,纯化的脂肪酶在SDS-PAGE上显示单一的蛋白条带,纯度>92%,纯化的脂肪酶的分子量为38kDa,比酶活为5035U/mg,纯化倍数为6.27,收率为27%。通过非变性电泳、等电聚焦活性染色以及双向电泳发现该脂肪酶存在分子量相同,而等电点有细微差别的四个同工酶,其等电点分布在5.0—6.5之间。氨基酸N末端序列测定和MALDI-TOF质谱分析发现该四个同工酶与来自酵母Yarrowialipolytica的胞外脂肪酶Lip2匹配,确定该四个同工酶由同一基因编码,翻译后修饰N-糖基化不同造成的。酶法去糖基化分析表明该脂肪酶为糖蛋白,大约含12%的糖分子。该脂肪酶的反应最适温度和pH分别为37℃和8.0。脂肪酶在35℃以下稳定,当温度超过40℃时,酶活性急剧下降。pH稳定性分析表明脂肪酶在pH5.0～8.0范围内稳定。20%乙醇、丙酮、异丙醇和乙腈使酶快速失活。Ca2+和Mg2+对脂肪酶活性有促进作用,而Zn2+和Ni2+对脂肪酶的活性有抑制作用,Cu2+则完全抑制脂肪酶的活性,金属离子螯合剂EDTA对脂肪酶的活性没有影响。表面活性剂TritonX-100、Tween80和Span65促进脂肪酶的活性,β—巯基乙醇、二硫苏糖醇和Span85对脂肪酶的活性没有影响,SDS抑制脂肪酶的活性。脂肪酶对长链不饱和的脂肪酸甘油酯表现出很高的活性。2.Candidasp.99-125胞外脂肪酶基因的克隆和在毕赤酵母中的表达根据Yarrowialipolytica胞外脂肪酶Lip2成熟肽序列设计引物,通过PCR得到Candidasp.99-125胞外脂肪酶的成熟肽基因序列并克隆到载体pPICZaA中。该基因序列由903碱基构成,相对应的氨基酸序列由301aa组成。该脂肪酶氨基酸序列中存在脂肪酶的保守五肽序列GHSLG,它与来自真菌的脂肪酶有较高的同源性,尝试了同源模建的方法来模拟ClLip脂肪酶的空间结构。将ClLip脂肪酶的成熟肽基因序列和C端带有6个组氨酸的序列CILip-His分别克隆到质粒pPICZaA中得到了重组质粒pPICZaA-ClLip和pPICZaA-ClLip-His。pPICZaA-ClLip重组质粒线性化后转化毕赤酵母GS115,通过高抗生素浓度(500μg/mlZeocin)筛选得到脂肪酶高产菌株C1Lip2-8口3-5。Southernblot杂交分析表明脂肪酶高产菌株2-8和3-5基因组中脂肪酶的拷贝数为3个,其胞外脂肪酶活性可达到550U/ml,而单拷贝转化子0-8胞外脂肪酶活性为350U/ml。来自ClLip-His菌株的胞外脂肪酶活性仅为50U/ml左右,分析原因是由于脂肪酶C末端添加的6个组氨酸影响了脂肪酶的折叠和空间构象,从而影响了脂肪酶的活性。3.重组脂肪酶的发酵生产、纯化以及性质分析发酵在5L发酵罐中进行,采用基础盐培养基。甘油批式培养结束后,采用溶氧控制的甲醇流加方式诱导单拷贝子0-8表达脂肪酶,培养192h后生物量OD600为346,脂肪酶的活性可以达到4460U/mL(0.92g/L)。同时也采用恒定甲醇浓度(5g/L)诱导单拷贝子0-8生产脂肪酶,这种条件下生物量OD600为350,脂肪酶的活性为4280U/mL与溶氧控制的甲醇流加方式得到的发酵结果相差不大。随后研究了恒定甲醇浓度控制条件下,多拷贝子2-8(3个拷贝)脂肪酶的生产,发酵进行162h后,生物量OD600为350左右,脂肪酶活性为11000U/mL,时空产率为67900U/L/h,发酵液中纯脂肪酶的产量为2.3g/L,为单拷贝子0-8的脂肪酶产量的2.4倍。发酵结束后对发酵上清液进行了分离纯化,采用简单的两步纯化法超滤和离子交换层析后得到了比酶活为4860U/mg的纯化脂肪酶,纯化的收率为85%,纯化倍数为2.29,脂肪酶的纯度为90％(SD-PAGE数据)。随后对纯化的重组脂肪酶进行了性质分析,重组脂肪酶的分子量为38kDa,最适反应温度和pH分别为37℃和8.0,对长链不饱和的甘油酯以及长链的脂肪酸(C12-C18)甲酯表现出高的活性。酶法去糖基化实验表明重组脂肪酶大约含有12%的糖分子。实验表明重组脂肪酶和原始脂肪酶具有相似的酶学性质。4.N-糖基化对脂肪酶分泌和酶学性质的影响通过定点突变将CILip脂肪酶的第113位和134位的N-糖基化位点Asn突变为Gln,从而去除N-糖基化,来研究N-糖基化对脂肪酶的分泌、活性和热稳定性的影响。脂肪酶在毕赤酵母中重组表达时,两个位点均发生糖基化,每个位点大约有2-3kDa的糖分子。胞外脂肪酶的表达量分析表明突变脂肪酶rClLip-N113Q、rClLip-N134Q和rClLip-N113-134Q的胞外分泌水平分别降低37%,36%和77%。热稳定性实验表明突变脂肪酶的T50值比野生型脂肪酶分别降低了3.5℃,2.6℃和4.2℃；酶动力学参数显示N113Q和N113Q-N134Q的Vmax比野生型的降低了44%和54%,而N134Q的Vmax值比野生型脂肪酶增加了15%。所有这些实验结果都表明rClLip脂肪酶的113和134位点的N-糖基化在酶的合成和功能发挥中扮演着极其重要的角色。
【作者】于明锐；
【导师】谭天伟；
【作者基本信息】北京化工大学，生物化工，2007，博士
【关键词】Candidasp.99-125；毕赤酵母；脂肪酶；同工酶；MALDI-TOF质谱；N-糖基化；

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