BubR1-CENP-E-SKAP信号通路调控细胞有丝分裂的分子机制研究

【摘要】在细胞复制过程中,包含在染色体中的父代遗传信息在经历诸多复杂的运动后均匀地、准确无误地传递给两个子细胞。整个细胞分裂过程是通过纺锤体丝与染色体着丝粒的协同作用来完成。正确的染色体与纺锤体丝相互作用是细胞健康的保证。同时染色体与纺锤体丝连接异常会导致染色体丢失、易位等,从而使细胞生长失控,如癌症的发生与发展。调控细胞有丝分裂可塑性及染色体稳定性的重要机制—纺锤体组装检验点在此过程中发挥了重要作用。但是,我们对纺锤体组装检验点信号通路的物质基础与调控机制知之甚少。为此,我的研究主要是围绕纺锤体微管有机衔接与纺锤体组装检验点信号通路展开了探讨。众多研究表明：CENP-E是一个调控动点—微管连接以及染色体双极定向过程的重要马达分子。但是CENP-E如何维系哺乳动物细胞分裂过程中动态的动点—微管连接至今尚未阐明。利用亲和色谱分离与质谱学分析相结合,我们鉴定出一个未曾鉴定过的CENP-E作用蛋白,SKAP。我的生物化学实验表明SKAP蛋白可以与CENP-E的羧基端直接结合,并通过此作用界面形成并维系正确的动点—微管连接。免疫电镜以及免疫荧光的实验均表明SKAP是哺乳动物细胞动点的冠状纤维层的组分,印证了此前的生物化学实验结果。利用特异性小干扰RNA降低靶蛋白水平,我们发现缺失SKAP或CENP-E蛋白的染色体动点间张力降低并由此导致染色体无法正确排列在赤道板上,提示SKAP及CENP-E在染色体运动中不可或缺。令人兴奋的是,我们发现SKAP蛋白在体外可以直接与微管结合,并且这种结合微管的能力会随着CENP-E蛋白的存在而加强。综合生化与细胞学实验,我们认为SKAP蛋白与CENP-E协同作用共同调控动点微管的动力学特征从而保证有丝分裂过程中染色体的稳定性。在有丝分裂过程中,当染色体的排列出现问题不能整齐排列队时,纺锤体检验点被激活,使得细胞不能进入后期,从而避免染色单体的超前不均等分离。这一机制保护了染色体稳定性,防范非整倍体的产生。BubRl作为纺锤体检验点复合物的蛋白组分之一,在纺锤体检验点中发挥着重要功能。BubRl含有丝氨酸激酶结构域,但其激酶活性在有丝分裂过程中的具体功能并没有得到详尽地解析。利用基于细胞表型的高通量筛选法,我们发掘了一个新型BubRl激酶化学分子抑制剂BIC1。通过体外磷酸化实验证实BIC1可以在体外抑制BubRl的激酶活性,其IC50为3μM。蛋白激酶特异性实验显示：BIC1在测试浓度10μM是仍对其有丝分裂调控蛋白激酶没有抑制作用,提示BIC1是一个特异性的BubR1激酶抑制剂。事实上,我们对BIC1的化学结构-抑制效果相关性研究确定了BIC1的官能基团并由此合成了BIC1的衍生物BIC2。在细胞学实验中,BIC1/2抑制BubR1的激酶活性、促进动点一微管连接的错误纠正机制失效、从而造成染色体排列异常并显著延长了染色体排列到赤道板的时间。有趣的是,BIC1抑制BubR1激酶活性并瓦解纺锤体检验点完整性。BIC1处理的细胞在染色体没有完全排列好的情况下进入后期,从而出现染色体不稳定性表型,说明BubR1的激酶活性是纺锤体检验点完全行使功能的必要成分。进一步的细胞生物学实验提示：BubR1蛋白激酶不仅参与纺锤体检验点调控,而且监控染色体排列及感知动点间张力的动态过程。基于我的研究结果,我设想：BubR1是将动点—微管连接与纺锤体检验点联系起来的关键偶联剂,通过调控BubR1-CENP-E-SKAP信号通路等生化调控机制维系染色体稳定性。目前,我正着手解析BubR1-CENP-E-SKAP信号通路在有丝分裂中期-后期转换过程中的分子动力学特征及其下游效应分子的详尽功能。我相信这些研究为进一步阐明有丝分裂过程中染色体完成其正确排列及染色单体分离的时空动力学调控机制奠定理论基础。随着细胞进入有丝分裂的后期,中心纺锤体形成并调控分裂沟位置的确定及组装的起始以及胞质分裂的进行。在这一过程中马达蛋白CENP-E定位在中心纺锤体上,此时CENP-E的马达活性发挥着什么样的功能是我们关心的另一问题。在有丝分裂后期使用特异性的化学小分子抑制剂syntelin抑制CENP-E的马达活性之后,中心纺锤体处的微管的组装和维系受到影响,反平行微管结构变得松散,不能形成正常的紧密捆绑结构,说明CENP-E的马达活性参与到中心纺锤体处反平行微管间的拉升滑行及浓缩过程。进一步的实验表明,syntelin处理后的细胞中,一些重要的参与中心纺锤体组装的蛋白定位也受到不同程度的影响,例如：MKLP1蛋白呈现中体微管附近的定位弥散,中体微管重要构架蛋白PRC1与CENP-E自身呈现出较为松散而宽泛的定位,提示中体微管的构架出现了差错。为探讨CENP-E在中期功能抑制对中体微管可塑性的影响,我们对PRC1进行了系统研究。我们发现PLK1通过磷酸化PRC1第602位苏氨酸调控了PRC1从纺锤体正端向中体微管移位的动力学特征。有趣的是,PRC1第602位苏氨酸的磷酸化受磷酸酶PP1γ的调控。为此,我们的研究揭示了CENP-E通过连接PRC1与磷酸酶PP1γ调控了PRC1磷酸化的动态性与分子功能,从而解答二十年来有关CENP-E马达蛋白在中体微管可塑性调控中功能的争议。综上所述,我的研究阐明了CENP-E与SKAP蛋白在动点—微管连接过程中的协同作用,提示BubR1-CENP-E-SKAP信号通路对动点—微管连接可塑性调控的重要性及潜在机制,同时初步解析了PP1γ-CENP-E-PRC1-PLK1信号轴在后期中心纺锤体组装与维系过程的功能。
【作者】黄月佳；
【导师】姚雪彪；
【作者基本信息】中国科学技术大学，细胞生物学，2012，博士
【关键词】纺锤体检验点；动点—微管连接；中心纺锤体；BubR1；CENP-E；SKAP；小分子抑制剂；

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