两个棉花(Gossypium hirsutum)LIM蛋白调控肌动蛋白细胞骨架及其在花药发育中的功能研究

【摘要】肌动蛋白(actin)在真核生物的生命活动中占据重要地位,它不仅是构建细胞骨架所必需的物质,而且也参与了真核生物生长发育中的很多过程。一旦肌动蛋白细胞骨架的动力学机制遭到破坏,真核生物的生命活动就会出现不同程度的畸变。在细胞中,一系列的肌动蛋白结合蛋白(ABP)参与了维持肌动蛋白动力学及其功能多样性。LIM蛋白作为一类重要的肌动蛋白结合蛋白,在很多植物中均有报道。它参与调控肌动蛋白丝的装配与解聚过程,包括成核、切割和成帽等。在棉花中,先前有报道指出,该类蛋白参与棉纤维发育调控过程的调控,但对于LIM蛋白在棉花花药发育中的功能研究却鲜有报道。本文对两个在棉花花药中高量表达的LIM蛋白基因(命名为GhPLIM1和GhPLIM2)进行了克隆鉴定,并对其编码蛋白的相关生化功能进行了分析,获得如下研究结果：1、GhPLIMl和GhPLIM2蛋白的亚细胞定位分析为研究GhPLIM1和GhPLIM2在棉花花药发育中的功能,探究GhPLIM1和GhPLIM2蛋白是否也如其他LIM家族蛋白一样能够与肌动蛋白细胞骨架相互作用,构建了pBI121-GhPLIM1-GFP和pMD-GhPLIM2-GFP融合蛋白表达载体,通过农杆菌LBA4404转化棉花,观察转基因棉花愈伤细胞,均可以观测到GFP荧光。在共聚焦显微镜下观测发现,GhPLIM1-GFP不仅分布在细胞质中,也具有细胞核定位信号。在细胞质中,GhPLIM1-GFP形成一个网络状分布,同时GhPLIM1-GFP荧光信号也在细胞核中有一定的积累。GhPLIM2具有与GhPLIM1类似的亚细胞定位。这说明GhPLIM1和GhPLIM2蛋白都可能是F-actin结合蛋白,且在细胞核中也有分布。2、GhPLIM1和GhPLIM2蛋白能够与肌动蛋白丝相互作用分别构建pET-28a-GhPLIMl和pET-28a-GhPLIM2原核表达载体,转化大肠杆菌BL21菌株,原核表达纯化GhPLIM1和GhPLIM2蛋白。将表达纯化的LIM蛋白与F-actin进行高速共沉淀实验分析,结果显示GhPLIM1和GhPLIM2蛋白均可与F-actin相互作用,形成相对分子质量较大的复合物,从而能在高速离心力的作用下沉降下来。3、GhPLIMl和GhPLIM2蛋白能够使肌动蛋白丝成束通过浓缩后的GhPLIM1和GhPLIM2蛋白与F-actin进行低速共沉淀实验分析,结果显示F-actinGhPLIMl和GhPLIM2均单独存在时,低速离心力均不能使其沉淀下来。而在F-actin中加入GhPLIM1或GhPLIM2蛋白后,F-actin与GhPLIM1或GhPLIM2都可以结合并离心沉降下来。这说明GhPLIM1和GhPLIM2均可以使F-actin成束,使其相对分子质量增加,从而在低速离心力的作用下也能被沉降下来。4、GhPLIM1蛋白能够稳定F-actin细胞骨架将不同浓度的GhPLIM1蛋白与F-actin一起孵育,之后加入LatB(一种F-acin抑制剂,能够使actin丝解聚),通过高速共沉淀实验使上清和沉淀分离。结果显示,未经过LatB处理时,F-actin绝大部分分布于沉淀中。加入LatB后,部分F-actin被解聚,分布于上清中。之后再加入GhPLIM1蛋白,能够抑制LatB对F-actin的解聚作用,并且随着GhPLIM1蛋白浓度的逐渐升高,其稳定F-actin的作用越明显。5、棉花遗传转化及转基因棉花植株的鉴定除上述两个LIM家族基因外,本文也对棉花(hWLIM5基因进行了研究。分别构建了pBI-35S-GhWLIM5RNAi、pBI-pTua9-GhWLIM5RNAi和pBI-pTua9-GhWLIM5OE(过量表达)载体,通过农杆菌LBA4404介导的棉花转化,获得大量转基因棉花植株(T0代)。目前,己收获到一些转基因植株的T1代种子,进一步的分析鉴定正在进行中。
【作者】李兰；
【导师】李学宝；
【作者基本信息】华中师范大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】棉花(GoSSypiumhirsutum)；肌动蛋白结合蛋白；LIM蛋白；F-actin；共沉淀；

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