有丝分裂期纺锤体可塑性的调控机制研究

【摘要】有丝分裂过程中最核心的事件是染色体的运动和分离,它主要是由纺锤体微管和定位于染色体着丝粒区域的动点之间的相互作用来调节的。着丝粒相关蛋白E(CENP-E)是一个在稳定动点与微管的连接方面以及维持纺锤体检验点功能中均有重要作用的马达蛋白。我们的目的旨在寻找与其有相互作用的蛋白,从而搭建一个完善的CENP-E相关的蛋白网络系统。通过酵母双杂交和串联亲和层析的技术,我们鉴定了两个新的CENP-E结合蛋白：SKAP和SEPT7。我们前期的工作主要是围绕这两个蛋白与CENP-E之间的相互作用展开的。而在本文中,我主要研究了这两个蛋白本身的生化特性和功能,从而去解析纺锤体可塑性的调控机制。我第一部分工作的重点是SKAP,它是一个纺锤体和微管相关的蛋白质。我们之前的研究证明：SKAP可以和CENP-E形成复合物,并协同作用调控微管与动点的连接以及染色体的排列和分离,但是我们仍然不清楚SKAP的动点定位以及具体调控纺锤体可塑性的机制。结合酵母双杂交实验与体外的pull-down实验,我们发现SKAP通过它的C端与Mis13有直接的相互作用,并且这一相互作用稳定了SKAP在动点的定位。如果用siRNA抑制Mis13的表达,SKAP在动点的定位将会受到很大的影响。同时,我们还证实SKAP参与调控动点的正常“震荡”和微管正末端的动态性。当我们用SKAP的siRNA抑制它的表达,动点原本具有的在赤道板附近持续震荡的行为受到了影响,并且微管正末端的动态性也有减弱。此外,我们还发现SKAP与微管的正末端蛋白Clasp1有相互作用,负责招募它上动点,而这又与微管正末端的动态性紧密关联。这些结果揭示了SKAP在纺锤体可塑性的调控方面发挥了至关重要的作用。我第二部分的工作则是围绕SEPT7展开的。Septin(SEPT)是细胞内第四类骨架蛋白体系,我们之前的研究结果揭示了SEPT7通过与CENP-E的相互作用,连接了septin纤维和动点,并参与调控动点和微管的连接。而在我的研究工作中,通过质谱学鉴定的方法和详尽的生化分析,我们首次发现了人源的septin蛋白具有乙酰化的修饰,并且证明了Tip60是一个负责SEPT7乙酰化的乙酰转移酶,它可以乙酰化SEPT7的第175位和201位氨基酸。通过体外的pulldown实验和体内的荧光共振能量转移(FRET)实验,我们证实了SEPT7的乙酰化改变了它与SEPT2/6/7复合物中各组分分子间的相互作用,影响了septin纤维结构的形成。联系到SEPT7在有丝分裂过程中发挥的作用,我们还进行了免疫荧光分析和活细胞成像去评估SEPT7的乙酰化在有丝分裂中的作用,发现SEPT7的乙酰化参与调控细胞周期的进程和后续染色体的排列和分离。我们的研究对进一步解析septin骨架组装的分子机制以及翻译后修饰在此过程中发挥的作用具有很重要的意义。
【作者】王茜玮；
【导师】姚雪彪；
【作者基本信息】中国科学技术大学，细胞生物学，2012，博士
【关键词】动点；微管；CENP-E；SKAP；Mis13；spindleplasticity；oscillation；SEPT7；乙酰化；

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