油茶种子脂肪酸代谢过程7个关键酶基因的克隆与功能研究

【摘要】油茶(Camelliaoleifera)是我国重要的木本食用油料树种,与油棕、油橄榄和椰子并称为世界四大木本食用油料树种,主要栽培分布于南方丘陵酸性红壤地区。茶油主要由油酸、亚油酸等不饱和脂肪酸组成,其含量一般在90%以上,是一种优质食用油。在油茶种子脂肪酸代谢的过程中,涉及到一系列调控生理生化代谢过程的酶和基因,其中包括参与饱和脂肪酸合成的装载酶-丙二酰单酰CoA:ACP转酰酶(MCAT),参与长链脂肪酸合成的脱水酶-3羟酰CoA脱水酶(HCD),参与脂肪酸p氧化的脂酰CoA脱氢酶(ACAD)、多功能蛋白(MFP)和脂酰CoA硫酯酶(ACOT),以及参与植物抗逆的醛脱氢酶(ALDH)和脂氢过氧化物裂解酶(HPL)。本研究是以国审油茶品种‘华硕’发育过程中的种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库的基础之上,对上述这些关键酶基因进行全长cDNA克隆和生物信息学分析；构建表达载体和干扰载体,让相关基因在不同的宿主细胞进行表达；开展了油茶脂酰CoA脱氢酶基因、醛脱氢酶基因和脂氢过氧化物裂解酶基因等3个基因转录水平的表达研究。主要研究结果如下：1.油茶脂肪酸代谢过程中7个关键酶基因的克隆与序列分析。根据转录组分析数据,分别设计简并或特异引物,采用RACE技术,克隆到油茶脂肪酸代谢和抗逆的7条基因的全长cDNA序列：(1)CoMCAT基因cDNA全长为1867bp,GenBank登录号为KJ910337,含有1131bp的开放读码框,编码376个氨基酸,分子量为39.9797kDa,理论等电点pI为6.84,具有58个氨基酸长度的导肽；含有两个高度保守的基序“GQGXQ”和‘’GXSXG”,它们分别位于nalonyl-CoA结合位点和ACP结合位点上；(2)CoHCD基因cDNA全长为1145bp,GenBank登录号为KJ910336,含有666bp的开放读码框,编码221个氨基酸,分子量为25.2045kDa,理论等电点pI为9.40；疏水残基占整个氨基酸残基的48.9%,是亲水性蛋白；具有四个比较明显的跨膜区和蛋白质酪氨酸磷酸酶基序”HGXXGXXRS”;(3)CoACAD基因cDNA全长为2702bp,GenBank登录号为KJ910338,含有2487bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113kDa,理论等电点pI为8.47,具有两个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点“LVHGDFRIDNLVF”,存在五个亚结构域即蛋白激酶域、氨基糖苷磷酸转移酶(APH)结合域、酯酰辅酶A脱氢酶N端域、酯酰辅酶A脱氢酶中心域和酯酰辅酶A脱氢酶C端域；(4)CoMFP基因cDNA全长为2541bp,GenBank登录号为KJ910342,含有2178bp的开放读码框,编码725个氨基酸,分子量为79.0333kDa,理论等电点pI为9.11,具有六个比较明显的跨膜区,存有ECH信号序列“VAAIDGLALGGGLEVAMACHA”、HCDH信号序列”NCTGFAVNRMFFPYTQAAILLVERGV”、ECH基序‘’-N25-P26-P27”和磷酸结合基序“319G-X-G321-X-X-G324″,且还具有相当保守的盐桥”RsooNε和E638Oε”、“R500Nη1/n2和E6450ε1/ε2”及活性位点S428、H449、E461、N499、D523等,存在五个亚结构域即ECH结合域、3HCDH_N端结合域、NAD(P)结合Rossmann-fold域、3HCDH_C端结合域和6-磷酸葡糖酸脱氢酶结合域；(5)CoACOT基因cDNA全长为1588bp,GenBank登录号为KJ910339,含有1164bp的开放读码框,编码387个氨基酸,分子量为43.5478kDa,理论等电点pI为7.14,存有cNMP结合域1保守序列“VVREGEAGDGVYFIWDG”,C端具有过氧化物酶体信号序列保守的三联肽“SKL”,存在环核苷酸结合域和类似于RmlC-jellyrollfold的结合域；(6)CoALDH基因cDNA全长为1809bp,GenBank登录号为KJ910340,含有1506bp的开放读码框,编码501个氨基酸,分子量为54.5137kDa,理论等电点pI为5.50,具有三个比较明显的跨膜区和36个氨基酸长度的细胞质基质转运肽,不仅含有醛脱氢酶基因家族的3个保守结构域即醛脱氢酶谷氨酸激活位点”LELGGKSP”、醛脱氢酶半胱氨酸激活位点‘’LYNKGEICVAGS”和辅酶结合位点”GFGPTAG”,还具有保守十肽“VSLELGGKSP”及高度保守的“FTGSTE”、”GPWPR”和‘’IIPMNFP”等序列,存在醛脱氢酶域,是属于依赖于NAD的醛脱氢酶家族；(7)CoHPL基因cDNA全长为1648bp,GenBank登录号为KJ910341,含有1476bp的开放读码框,编码491个氨基酸,分子量为54.8581kDa,理论等电点pI为8.04,具有五个比较明显的跨膜区和由21个疏水氨基酸残基组成且富含脯氨酸的38个aa长度的叶绿体转运肽,含有细胞色素P450蛋白家族的4个保守结构域即结构域A(螺旋I区)”LFMLGFNAYGGYSIF”、结构域B(螺旋K区)‘’LSFDSVKEMELVKSFVYETLRLNPP”、结构域C”RDSKVFDDPEKFIFDRF-TKEK”和结构域D(血红素结合区)‘’PSESNKQCAAKDYVTLACL”2.油茶基因的原核表达。采用pET30a和BL21(DE3)原核表达体系,成功构建了pET30a-MCAT、pET30a-HCD、pET30a-ACAD、pET30a-MFP、pET30a-ACOT,pET30a-ALDH和pET30a-HPL的重组表达质粒,并分别获得了表观分子量约为4OkD、5kD、93kD、79kD、44kD、551D和55kD相应的目的蛋白。3.油茶基因ACAD,ALDH和HPL在油茶种子不同发育时期的相对表达量。采用实时荧光定量PCR分析了13个不同发育时期油茶种子中CoACAD、CoALDH和CoHPL相对表达量：(1)CoACAD基因在‘华硕’种子发育过程中有三个转录高峰,分别是在8月初、9月底和10月中旬；(2)CoALDH基因的表达出现了三个转录高峰,分别是在8月上中旬、9月底及10月中旬；(3)CoHPL基因高效地表达主要集中于8月,转录最高峰发生在8月初。4.油茶基因真核表达载体的构建及CoALIDH和CoHPL基因的遗传转化研究。分别构建了CoMCAT、CoHCD、CoACAD、CoMFP、CoACOT、CoALI)H和CoHPL的超表达载体和RNA干扰载体,CoALDH和CoHPL基因的真核表达载体农杆菌介导转化哥伦比亚野生型拟南芥,筛选都获得了T0代转基因拟南芥,经抗生素筛选和PCR检测均初步获得了转基因T1代阳性植株。
【作者】王建勇；
【导师】谭晓风；
【作者基本信息】中南林业科技大学，生物化学与分子生物，2014，硕士
【关键词】油茶；脂肪酸代谢；基因克隆；基因表达；RNA干扰；

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