转TiERF1基因油菜的获得及分子检测

转TiERF1基因油菜的获得及分子检测

作者:师大云端图书馆 时间:2024-07-10 分类:硕士论文 喜欢:1217
师大云端图书馆

【摘要】油菜是我国重要的油料作物。近年来,由核盘菌所引起的油菜菌核病已成为严重影响油菜生产。推广和选育抗菌核病油菜品种是控制该病害最安全、经济和有效的措施。然而,目前缺乏有效的抗菌核病油菜品种,基因工程技术为油菜抗抗菌核病育种提供了一条新途径。本研究利用已有的单子叶植物表达载体pA20-TiERF1,构建双子叶植物表达载体pBI121-TiERF1,在建立油菜再生体系及遗传转化体系的基础上,采用农杆菌介导法,将TiERF1基因转入甘蓝型油菜湘油15号和中双9号中,获得了转基因油菜植株。主要结果如下:1.pBI121-TiERF1植物表达载体的构建根据TiERFl基因序列,使用primer5软件设计引物,并加入BamHI和SacI酶切位点,采用PCR扩增TiERF1基因,并将其连接到pEASY-T1载体上进行测序。测序结果表明:扩增片段与原有TiERF1序列完全一致,没有发生错配。将pEASY-T1-TiERF1载体和pB1121载体分别用BamHI和SacI双酶切,将得到的TiERF1片段与pBIl21载体片段连接,构建表达载体pBI121-TiERF1。通过冻融法将其转化农杆菌LBA4404,并进行菌落PCR检测。2.中双9号再生体系的建立在所筛选的生长素浓度配比中,中双9号最佳预培养基为MS+1.0mg/L6-BA+1.0mg/L2.4-D,最佳分化培养基为MS+3.Omg/L6-BA+0.02mg/LNAA+4.5mg/LAgNO3,再生率为92.5%。3.中双9号和湘油15号遗传体系的优化通过单因素对农杆菌转化效果的研究表明:湘油15号对TiERF1基因最优转化条件为:选取5d苗龄的幼苗,预培养3d、菌液OD600为0.6,侵染5mmin,共培养2d,加入AS200nmoI/L;中双9号对TiERFl基因最优转化条件为:选取5d苗龄的幼苗,预培养3d、菌液OD600值0.4,侵染5min,共培养2d,加入AS200μmol/L。4.中双9号和湘油15号再生植株的获得及分子检测在经过Kan严格筛选后获得湘油15号抗性植株8株,中双9号抗性植株9株。对再生植株进行PCR检测得到湘油15号阳性植株4株,中双9号阳性植株5株,分别占再生植株的50.00%和55.56%。本研究获得了转TiERF1基因油菜。
【作者】刘茜;
【导师】王爱云;
【作者基本信息】中南林业科技大学,遗传学,2014,硕士
【关键词】甘蓝型油菜;TiERF1基因;农杆菌介导法;PCR;

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