原生质体融合技术进行纤维素酶新菌株的选育及发酵研究

【摘要】纤维素酶(cellulase)可降解纤维素为糖类被人类利用,故被广泛应用于工业生产。目前国内外对纤维素酶的研究主要以木霉属、青霉属、曲霉属的真菌为主。青霉属(Penicillium)真菌可分泌较为全面的聚糖酶系,而且酶系中p-葡萄糖苷酶的量比木霉纤维素酶分泌的更多,但是青霉属真菌对酸碱及温度的适应性不强,所产纤维素酶的活力不高。枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)具有耐热、耐酸碱、耐旱、抗紫外线和耐有机溶剂等强抗逆性。选用产纤维素酶的青霉Q5和具有抗逆性的枯草芽胞杆菌K3为亲本,利用原生质体融合技术,获得既能够分泌高产纤维素酶又具有强抗逆性的融合菌株,其研究结果如下：通过对菌体生长浓度测定、显微镜观察计数和再生率计算等方法,对双亲原生质体的形成与再生进行优化。结果表明：亲本菌株青霉Q5酶解前,在其菌丝培养液中加入质量浓度0.5%的甘氨酸和质量浓度10%的蔗糖,能够促使菌丝体较好的分散,利于酶解；在溶菌酶和蜗牛酶共同作用下进行酶解,质量浓度均为10mg/ml;35℃处理3h；原生质体生成量达到最大值,为6.85×106cfu/mL;亲本菌株枯草芽胞杆菌K3酶解前,用4U/mL的青霉素处理,在1mg/mL的溶菌酶作用下,35。C处理1h,原生质体量达到最大值,为1.46×107cfu/mL。利用高温和紫外照射的处理方式对原生质体灭活,通过原生质体的再生率确定双亲原生质体的灭活条件。结果表明,在65℃的水浴处理下,青霉菌Q5最佳热灭活的时间为2h,枯草芽胞杆菌K3最佳热灭活的时间是2.5h；在距30W紫外灯20cm处照射下,Q5最佳紫外灭活时间为15min;K3最佳紫外灭活时间为25min。采用聚乙二醇(PEG)法和高Ca2+高pH法相结合诱导原生质体融合,通过正交分析,得到融合的最佳条件是融合温度为38℃,融合时间10min,PEG浓度为40%,在该条件下的融合率为3.08×10-7。依据再生培养基上出现的菌落的形态和颜色,以及在刚果红培养基上呈现的透明圈大小进行分离,获得了5株融合子,分别是R8,R17,R35,R62,R158菌株。通过形态特征观察、生理生化分析、遗传稳定性及抗逆性研究,筛选获得了性状优良(酶活较高且抗逆性较强)的融合子R62,该融合子在pH8时保留pH6时酶活的74.01%,在pH10时保留了其在pH6的最适条件下酶活的57.35%。经过高温60℃加热处理15min后,R62所产酶活较室温处理的青霉酶活提高了37.66%,较60℃处理后的青霉酶活提高了6倍。利用融合菌株R62为出发菌株,对其发酵培养基和摇瓶发酵条件进行优化研究,通过单因素试验、响应面试验确定最适产酶培养基配方为：淀粉2.99%、药媒3.02%、微晶纤维素4.04%、硫酸铵1.5%；最适产酶条件为转速220r/min、温度30℃、pH为5.5、发酵时间108h,得到纤维素酶活为189.39U/mL,相较于未优化前酶活提高了6.0%。
【作者】李淼；
【导师】曾柏全；
【作者基本信息】中南林业科技大学，发酵工程，2014，硕士
【关键词】原生质体融合；青霉；枯草芽胞杆菌；纤维素酶；菌种选育；

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