多重PCR同步检测MDV、APV和EDSV的技术研究

【摘要】家禽养殖在我国具有悠久的历史,随着我国经济快速的发展,养禽业的发展规模与速度与日俱增,而制约其发展的主要难题是禽病,尤其是病毒性疾病。其中APV、MDV和EDSV是三种鸡的B类传染性疾病。通常,用于检测病原体的主要方法有病毒的分离与鉴定、血清学鉴定以及PCR方法等。本文所要研究的多重PCR方法虽与常规PCR原理相同,但可以用于多种病毒的检测,且与常规单一PCR一样灵敏,是一种快速、有效的检测方法,在病毒检测领域具有广泛的应用市场。本研究利用DF-1鸡胚成纤维细胞分别增殖了MDV、APV和EDSV,并利用异硫氰酸胍法提取病毒DNA,然后根据三种DNA序列分别设计了1对特异性引物,并将扩增的片段克隆到pMD18-T载体中,以此建立了可同时检测三种病毒的多重PCR方法,并优化了多重PCR反应条件,最终确定了多重PCR反应体系为20μL:0.2μLGoTaqFlexiDNApolymerase(5U/μL),4μL5×GoTaqFlexibuffer,0.4μLdNTP(1OmM),2.4μLMgCl2(25mM),APV-F/R0.4μL,MDV-F/R0.4μL,EDSV-F/R0.2μL,模板各1μL,灭菌水8.0μL；反应程序为：94℃,5min;94℃,30s,54℃,30s,72℃,30s,循环40次；最后72℃,1Omin。利用优化后的多重PCR方法分别检测了MDV、APV、EDSV以及任意组合,反应结果与预期结果一致,还检测了其他对禽类危害也较大的病毒,如NDV、AIV、ALV、IBDV和IBV,均无扩增片段,说明该方法具有较强的特异性。利用构建的阳性克隆质粒,研究了多重PCR检测的灵敏度,多重PCR检测APV的灵敏度为103copies/μL,检测MDV和EDSV的灵敏度同为104copies/μL。并且讨论了多重PCR与单一PCR检测一种病毒的灵敏度以及多重PCR中另一种病毒对检测该病毒灵敏度的影响。利用建立的多重PCR方法检测了30份从本地农贸市场收集的禽粪便样,包括蛋鸡粪便样、乌鸡粪便样、鸭粪便样以及鸽子粪便样,发现没有阳性结果,但是若人为污染这些粪便样,将病毒液人为加到粪便样中,可以利用该方法检出。同样,采用此方法从13份南极企鹅粪便样和2份贼鸥粪便样中检出了MDV。因此,本方法这种快速、灵敏而且特异性强的优势,有助于研究三种病毒的流行病学、临床诊断以及控制疫病。
【作者】张栋梁；
【导师】杨继红；
【作者基本信息】华中师范大学，水生生物学，2014，硕士
【关键词】多重PCR；马立克氏病毒；禽痘病毒；减蛋综合征病毒；病原检测；

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