ATPsyn-b基因敲降对果蝇精子发生和幼虫生长的影响

【摘要】Wolbachia是一种胞内共生菌,主要存在于节肢动物和线虫体内,能够通过多种机制调节宿主的生殖,如细胞质不相容(CI)、孤雌生殖、雌性化、杀雄等。CI是Wolbachia对宿主产生的最普遍的一种影响。CI是指感染Wolbachia的雄性宿主与未感染Wolbachia的雌性宿主交配,或者是感染了不同种类Wolbachia的雌、雄性宿主之间交配后,其受精卵孵化率很低甚至完全不能孵化,但感染相同种类Wolbachia的雌、雄性宿主交配后就能够产生孵化率正常的受精卵。关于Wolbachia引起CI的分子机制,目前还不是很清楚。ATPsyn-b是果蝇体内编码线粒体膜上FoFl型ATPaseFob亚基的基因,参与果蝇体内氧化磷酸化过程,参与合成ATP,为果蝇的生命活动提供能量。为了研究CI产生的机制,本实验组前期研究发现,Wolbachia感染使得果蝇三龄幼虫精巢中ATPsyn-b基因的表达量发生了显著下调。另外,双链RNA注射成蝇后导致雄蝇的后代胚胎孵化率较对照组显著降低,该结果说明ATPsyn-b基因敲降能够影响雄蝇的繁殖能力。为了研究ATPsyn-b基因在果蝇生殖和生长发育过程中所起的作用,我们从清华大学果蝇模式中心购买了ATPsyn-b基因的RNAi转基因黑腹果蝇,该转基因果蝇在UAS-Gal4系统诱导下能表达发卡状结构(ATPsyn-b-hp)引起基因敲降,从而获得分别在精巢敲降或全身广泛敲降的突变体。首先,我们将ATPsyn-bRNAi转基因雄蝇与BamGal4vpl6品系处女蝇进行交配,获得ATPsyn-b基因在精巢敲降的果蝇(Bam-Gal4;ATPsyn-b-hp),同时以W1118与BamGal4vpl6品系处女蝇交配后的子代(Bam-Gal4;W-)作为对照。将ATPsyn-b在精巢中敲降和未敲降的1d雄蝇分别与DmelT雌蝇交配,统计其后代胚胎孵化率。结果发现,ATPsyn-b基因在精巢敲降后,其后代胚胎孵化率为零,而对照组胚胎孵化率可达89.81%。因此我们得出结论：ATPsyn-b在精巢中敲降后造成了雄性不育。为了确定该雄性不育是由ATPsyn-b基因在精巢中的表达下调引起的,我们通过qRT-PCR检测了实验组和对照组雄蝇精巢中ATPsyn-b基因的表达量。结果显示,ATPsyn-b基因在突变体雄蝇精巢中的表达量发生了极显著性下调(p<0.01),从而说明了突变体雄性不育是由ATPsyn-b基因表达下调引起的。为进一步找到突变体雄性不育的原因,我们对实验组和对照组雄蝇精巢进行DAPI染色,结果发现,突变体在精子延伸过程中,精子核不能够聚集形成精子束,而是完全处于分散状态,并呈现出短小的形态。另外在精巢末端的储精囊中没有个体化的成熟精子。该结果证明,ATPsyn-b基因在精巢中敲降造成了精子发生过程出现异常现象,不能产生成熟精子,并最终导致雄性不育。我们又将ATPsyn-bRNAi转基因雄蝇与ActGal4/Cyo-PscGFP处女蝇进行交配,使得ATPsyn-b在全身广泛敲降,结果发现羽化后的成蝇全部是卷翅果蝇,说明ATPsyn-b全身广泛敲降的果蝇(Act-Gal4;ATPsyn-b-hp)不能发育至成蝇阶段,而其姐妹型果蝇(Cyo-PscGFP;ATPsyn-b)却能够正常发育至成虫期。为确定ATPsyn-b全身广泛敲降的果蝇在什么时期死亡,我们在一龄幼虫期根据幼虫是否带有GFP将基因未敲降和敲降幼虫区分开,不带GFP的幼虫(Act-Gal4;ATPsyn-b)为ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫。同时以W1118与ActGal4/Cyo-PscGFP交配后的子代(Act-Gal4;W-)作为对照。结果发现,当对照组的幼虫已经进入了三龄幼虫末期时,实验组幼虫仍然处于二龄幼虫大小；当对照组幼虫化蛹、羽化出成蝇后,实验组幼虫仍未达到三龄幼虫大小,且不能化蛹,其幼虫期长达15d以上,但最终逐渐死亡。为了证明ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫生长受阻与ATPsyn-b基因表达下调有关,我们通过qRT-PCR对ATPsyn-b基因在实验组和两个对照组幼虫中的表达量进行了检测。结果显示,ATPsyn-b基因在实验组幼虫全身的表达量发生了极显著性下调(p<0.01)。从而证明了突变体生长发育受阻是由ATPsyn-b基因表达下调引起的。为进一步研究ATPsyn-b基因广泛敲降的幼虫生长发育受阻的原因,我们通过喂养的方法,对实验组和对照组幼虫进行Brdu标记。Brdu掺入实验结果显示,实验组幼虫的前肠细胞核显著小于两个对照组,细胞体积也显著小于对照组。由于肠的细胞核是随着细胞DNA复制而增大的,所以很可能是因为DNA复制受到了阻碍,核体积不能增大,细胞体积亦不能增加。因此我们得出结论,ATPsyn-b全身广泛敲降个体生长发育受阻的主要原因可能是细胞体积不能够增加,而且很可能是由于DNA复制受阻造成的。我们的研究结果表明,ATPsyn-b基因在精巢中敲降能够产生成活的成蝇,但其雄蝇的精子发生过程存在严重的缺陷,且不能产生成熟精子,最终造成雄性不育。ATPsyn-b基因在全身广泛敲降导致果蝇生长发育受阻,原因可能为DNA复制缺陷使细胞核和细胞体积不能增大。这些结果表明,ATPsyn-b在果蝇精子发生和生长发育的过程中起着重要的作用。由于ATPsyn-b不仅被鉴定为果蝇的精子蛋白,同时也被鉴定为小鼠和人类的精子蛋白,因此对ATPsyn-b在果蝇精子发生过程中的作用的研究可为进一步了解ATPsyn-b在人类男性生殖过程中的作用提供有力的模型和新的线索。
【作者】陈亚娜；
【导师】王玉凤；
【作者基本信息】华中师范大学，动物学，2014，硕士
【关键词】黑腹果蝇；雄性不育；精子发生；生长发育；ATPsyn-b；

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