乳腺癌干细胞来源的内皮细胞参与肿瘤血管形成

【摘要】肿瘤干细胞(Cancerstemcells,CSCs)是肿瘤细胞中表达干细胞相关标志的亚群,具有高增殖能力和多向分化潜能。血管新生是许多肿瘤转移的先兆,与肿瘤细胞脱落进入血液循环发生转移同时发生。研究表明,肿瘤干细胞能参与肿瘤血管的生成,多种细胞表面受体、生长因子和酶参与其中。已有研究证实在脑胶质瘤中存在肿瘤干细胞分化为内皮细胞参与肿瘤血管的形成。本实验旨在研究是否存在乳腺癌干细胞来源的内皮细胞参与肿瘤血管的形成。目的：证实乳腺癌干细胞具有向内皮细胞分化的能力,并且该部分细胞能参与肿瘤血管的形成。方法：收集人乳腺癌标本,一部分标本制备成组织切片后,首先采用免疫组织化学方法检测肿瘤血管中P53、CD31、VEGF、HER-2的表达,然后采用免疫荧光化学技术检测肿瘤血管中CD31和HER-2的共表达,并用激光共聚焦显微镜证实,HER-2的表达进一步采用荧光原位杂交方法证实其扩增。另一部分标本进行细胞消化制备单细胞悬液,然后采用免疫磁珠分选(MACS)方法从中分选CD44+/CD24-/low细胞,分选得到的细胞接种至含有20μg/LEGF、20μg/LbFGF、2%B27的DMEM/F12干细胞培养基悬浮培养,培养1-2w后收集乳腺球细胞,用0.25%胰酶细胞消化液消化细胞制备单细胞悬液后,以105/ml接种至纤粘蛋白包被的六孔板,培养体系为EGM-2内皮细胞培养基。六孔板长满后进行消化传代后接种至25cm2培养瓶,培养细胞采用流式细胞学方法检测其内皮细胞表面标志CD31和CD105的表达和摄取乙酰化低密度脂蛋白(Ac-LDL)的能力,并在体外进行三维胶培养,观察其脉管样结构形成。结果：乳腺癌标本石蜡切片中均可观察到CD31、VEGF、突变型P53、HER-2的表达,并沿着血管腔或血管球排列。激光共聚焦显微镜下可观察到乳腺癌血管中CD31和HER-2同时表达。荧光原位杂交技术可在乳腺癌组织中检测到HER-2扩增。分离的乳腺癌细胞进行免疫磁珠分选,分选前细胞中CD44+细胞比例为7.1%±2.9%,经免疫磁珠分选后细胞中,CD44+细胞为94.5%±5.1%,最高达99.9%；分选前细胞中CD24+细胞比例为43.6%+9.7%,经免疫磁珠分选后CD24+细胞比例为3.7%+0.9%,CD24+细胞比例越低,则CD24-/low细胞比例越高,即CD24-/low细胞最高达95%。CD44+/CD24-/low经干细胞培养体系培养后,能形成乳腺球。将乳腺球细胞消化后经EGM-2内皮细胞培养体系培养后收集P1代细胞行流式检测,乳腺球细胞中CD105+细胞比例为4.8%±0.6%、CD31+细胞比例为0.5±0.2%,经内皮细胞培养体系培养后的P1代细胞中,CD105+和CD31+细胞率分别为42.1%±7.8%和92.1%+4.7%。最高达49.1%和97.4%。且培养后的细胞能摄取DiI-Ac-LDL,同时培养后的细胞通过三维胶培养能形成脉管样结构。结论：1)乳腺癌组织中部分血管内皮细胞与肿瘤细胞具有同源性。2)乳腺癌细胞能分离出CD44+/CD24-/low细胞,经干细胞培养体系培养后可形成乳腺球。3)CD44+/CD24-/low乳腺癌干细胞体外培养可分化为内皮细胞。
【作者】彭浪；
【导师】段华新；
【作者基本信息】湖南师范大学，内科学，2014，硕士
【关键词】乳腺癌干细胞；内皮细胞；血管形成；免疫磁珠分选；

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