发光杆菌双元毒素PirAB的细胞毒性研究

【摘要】发光杆菌(Photorhabdusluminescens)是一类格兰阴性、与异小杆线虫(Heterorhabditis)共生、定殖于线虫肠内的昆虫致病微生物。发光杆菌进入靶标昆虫血腔后,大量繁殖并释放一系列毒素毒杀靶标昆虫,主要四大类：毒素复合体(Tc)、致软因子(Mcf)、发光杆菌毒力盒(PVC)和双元毒素(PirAB)。其中,大部分毒素报道具有细胞毒性,其中Tc毒素通过一个与注射器类似的机制来发挥作用,将毒素输送至靶细胞。Mcf致虫体软化,使细胞骨架重排致其凋亡。PVC损害昆虫血细胞,使细胞骨架聚合。但是,有关PirAB细胞毒性的研究尚未见报道。PirAB双元毒素不但对大蜡螟、小菜蛾等农业害虫具有口服和注射毒性,而且对冈比亚按蚊、尖音库蚊、埃及伊蚊也表现出较高的毒杀作用。为了研究PirAB毒素的细胞毒性,探讨其在抵抗昆虫体液免疫中发挥的作用,本研究异源表达了PirAB毒素,并对其细胞毒性进行了研究。本研究以P.luminescensTTO1菌株基因组为模版,PCR扩增了编码PirAB毒素的基因plu4092-plu4093,连入表达载体pETDuet-1,构建了表达载体pET-pirAB,转入宿主菌E.coliRosetta(DE3)中。SDS-PAGE分析表明,PirAB毒素经IPTG诱导后在Rosetta(DE3)中为可溶性表达。PirAB毒素经Ni-NTA纯化、透析脱盐后,与枞色卷蛾中肠细胞CF-203孵育。MTT数据表明,PirAB双元毒素对CF-203细胞的毒力呈现浓度依赖性。孵育24h后,CF-203细胞的形态已不能保持完整的球形,细胞膜边缘出现褶皱,且有内容物渗出；台盼兰染色表明,PirAB毒素影响了细胞膜的通透性。激光共聚焦显微镜进一步观察发现,与对照相比较,CF-203细胞的微管蛋白荧光强度大幅度减弱,推测PirAB毒素导致细胞微管的解聚,微管蛋白其潜在作用靶点。裂解CF-203细胞并提取基因组,发现DNA呈现片段化,表明PirAB毒素对细胞可能具有致凋亡作用。本研究还构建了PirAB融合毒素,并对其毒性进行了研究。plu4092基因和plu4093基因通过一段柔性接头连接,置于cry1Ac基因启动子及终止子的调控下,构建了PirAB融合毒素的表达载体pHT1AcPT-fusion。PirAB融合毒素在苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis)无晶体突变株XBU001中能高效表达形成包涵体,包涵体经发酵提纯、溶解后,对甜菜夜蛾四龄幼虫具有注射毒力,能引发幼虫黑化,并导致其死亡本研究对PirAB双元毒素的细胞毒性进行了描述,并对其可能的作用机制进行了探讨,为阐明PirAB毒素在发光杆菌抵抗昆虫细胞免疫中发挥的作用奠定了基础。PirAB融合毒素对甜菜夜蛾四龄幼虫的注射毒性,也为开发新型杀虫剂提供了方案。
【作者】李宇晟；
【导师】胡胜标；
【作者基本信息】湖南师范大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】双元毒素；细胞毒力；注射毒力；

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