刺糖多孢菌发酵培养基优化及发酵工艺研究

【摘要】新型绿色生物农药多杀菌素是由土壤放线菌刺糖多孢菌(Saccharopolysporaspinosa)经有氧发酵而产生的大环内酯类次级代谢产物,因其具有杀虫谱广,杀虫活性高以及高效、安全、低残留、对环境友好等特点,已成为当前国际上最具开发前景的生物农药。通过培养基优化来提高发酵产物的效价,是发酵工艺研究中一个很重要的手段。本研究中采用混料设计法,对刺糖多孢菌发酵培养基成分进行优化,期望获得最佳发酵培养基配方。实验中首先采用Plackett-Burman实验设计,研究了葡萄糖、可溶性淀粉、蔗糖、棉籽粉、碳酸钙、豆饼粉、糊精和玉米浆等8种培养基成分对刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素能力的影响。实验结果显示葡萄糖、棉籽粉、玉米浆、豆饼粉4种营养成分对多杀菌素的产量影响较显著。随后设定这4种成分所占的比例,利用D-最优混料设计对上述4种显著性因子进行最优化设计,以多杀菌素的产量为期望,获得了响应值与变量之间的二阶拟合方程模型,该模型的复相关系数R2=99.38%,表明该模型的拟合性较好。根据拟合方程得到的最佳发酵培养基配方为葡萄糖59g/L,棉籽粉28g/L,玉米浆6.5g/L,豆饼粉6.5g/L。按此优化后的配方在20L发酵罐上进行分批发酵,产量达到249.9mg/L,比原始发酵培养基提高了15.16%。目的产物合成过程中的前体物质在发酵过程中起到重要作用,通过补加适当的前体物质,可以有效的提高发酵产物效价。本实验中,选取6种可能性的前体类物质进行单因素实验,实验结果显示,赖氨酸、谷氨酸、鱼粉蛋白胨和正丁醇4种物质对产量有促进作用,而乙酸钠和正丙醇对多杀菌素的产量有抑制作用,选取上述4种具有正效应的物质进行正交设计,通过发酵实验表明：4种物质对多杀菌素产量高低影响的主次关系为：鱼粉蛋白胨>赖氨酸>谷氨酸>正丁醇,最佳配比为：谷氨酸(1.5g/L),赖氨酸(2.0g/L),鱼粉蛋白胨(2.5g/L),正丁醇(0.4ml/L)。按此配方进行发酵,多杀菌素产量达到248.3mg/L,比优化前(216mg/L)提高了14.95%。本文研究了多杀菌素提取工艺。采用溶媒萃取——反萃取法提取多杀菌素时,发现乳化现象较严重,乳化层中不仅含有部分多杀菌素,同时还含有大量的色素等杂质,这些杂质直接影响着提取后样品的纯度。为提高多杀菌素提取物的纯度,本实验中对乳化层和萃取相进行单独收集提取,随后通过0.22um进行过滤提纯,再冷冻干燥后获得样品。测定表明,从乳化层中得到的多杀菌素的收率为72.7%,纯度为61.5%,而从萃取相中得到的多杀菌素的收率为85.71%,纯度达到97.6%,获得了纯度较高的多杀菌素样品。多杀菌素的发酵周期长达12-14天,产量低,发酵生产成本高,其发酵生产工艺的研究有待突破。本文中研究了多杀菌素发酵培养基优化、前体物质对多杀菌素产量的影响及其发酵液的提取工艺,并逐步从摇瓶发酵扩大到发酵罐发酵,至发酵下游的提取工艺条件的实验,为多杀菌素最佳发酵工艺条件的建立提供了重要基础,在应用上具有一定的参考价值。
【作者】阎宝清；
【导师】夏立秋；
【作者基本信息】湖南师范大学，发酵工程，2014，硕士
【关键词】刺糖多孢菌；多杀菌素；D-最优混料设计；发酵工艺；提取工艺；

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