大肠杆菌cDNA文库的建立及与RNaseⅢ有相互作用蛋白的筛选

【摘要】真核生物RNA干扰过程可分为三步：首先一个长的双链RNA(在细胞内表达或外源导入),在Drosha和Dicer两种RNaseIII酶作用下,加工成小双链RNA；第二步双链解旋,其中一条链装载到RNA-inducedsilencingcomplex(RISC)蛋白复合中；第三步,RISC复合物介导切割与siRNA互补区域的目的mRNA分子,从而阻止靶基因的表达。此过程中RNaseIII起重要作用,主要Drosha和Dicer两种RNaseⅢ家族的酶参与siRNA剪切成熟过程。2002年,YangD等人发现大肠杆菌的RNaseIII能将双链的RNA剪切成有干扰作用的siRNA混合物[1],从而介导RNA干扰。因此推测细菌RNaseⅢ可能在原核生物处理外来RNA过程中起作用。本研究以大肠杆菌RNaseIII在原核生物中的作用为切入点,采用细菌双杂交的方式从构建的细菌cDNA文库中钓取与大肠杆菌RNaseⅢ有相互作用的蛋白,并研究这些蛋白与RNaseIII在原核生物处理外来RNA过程中所起的作用,以帮助确认原核生物中是否存在类似真核生物的RNA干扰过程。采用stratagene公司的cDNA文库构建试剂盒构建大肠杆菌的cDNA文库。用Trizol试剂提取大肠杆菌的总RNA,在E.colipoly(A)Polymerase作用下给mRNA特异性地加上poly(A)尾,分离纯化mRNA,利用mRNA作为模板反转录合成双链DNA。经pfx酶补平双链末端,在两端加上EcoRI接头,XhoⅠ酶切消化产生粘性末端。用CHROMASPIN-400column分级分离纯化cDNA片段,与pTRGXR载体连接后,电击转入XL1-BLUEMRF’菌电转感受态中。得到原始文库,经计算文库的容量达到3×106个克隆。用PCR方法测得文库的重组率为100%,插入片段的平均长度基本位于300bp以上,测定放大文库的滴度为：3.15×1010pfu/mL。说明构建的大肠杆菌cDNA文库质量比较高,适合用于筛选目的基因克隆。文库的筛选,将pBT-RNaseⅢ质粒和pTRG-cDNA文库质粒电击共转入XL1-BLUEMRF’筛选菌中。在筛选平板上两次筛选后得到379个克隆,挑取这379个克隆做菌落PCR,对PCR产物按大小分组后再经MSPI酶切,剔除酶切片段一致的克隆,最终得到169个克隆。其中有35个克隆重复次数达到三次以上,全部测序后在NCBI中做BLAST比对,发现大部分的克隆为16SrRNA和23SrRNA,也发现一些与糖代谢有关的酶,如吡哆醛激酶、转酮醇酶、异柠檬酸脱氢酶等,或许细菌RNaseⅢ酶也参与细菌的糖代谢。本次主要研究16SrRNA克隆,在体外经GST-PULLDOWN实验证实NaseⅢ和16SrRNA片段在体外存在相互作用。而将RNase111分为C端结构域和N端结构域后,发现分段后的RNaseⅢ与16SrRNA片段的相互作用远弱于与完整RNaseⅢ的相互作用,说明RNaseⅢ的两个结构域对RNaseⅢ与16SrRNA片段相互作用都是必需的。通过半定量PCR验证发现16SrRNA与RNaseIII相互作用后能增强RNaseIII的剪切活
【作者】肖业；
【导师】向双林；
【作者基本信息】湖南师范大学，生物化学与分子生物学，2014，硕士
【关键词】大肠杆菌；细菌双杂交；cDNA文库；RNaseⅢ；16SrRNA；

【参考文献】
[1]马占新.一种基于样本评价集群竞争环境与组合效率的方法[J].控制与决策,2008,04:420-424+430.
[2]徐秀杰,张永德.现场总线PROFIBUS-PA智能从站模拟量输入接口模块设计[J].冶金自动化,2004,02:72.
[3]王军婷.传统文化视域下中国动画片创作面临的问题及对策研究[D].扬州大学,教育技术学,2011,硕士.
[4]张强.姜黄素对高浓度葡萄糖培养RF/6A细胞的保护作用[D].辽宁医学院,人体解剖与组织胚胎学,2012,硕士.
[5]王亮,王新宝,高亮,何强,陈松林,孙光辉.基于故障场景的区域电网安全稳定控制系统测试方法[J].电力系统自动化,2007,18:39-42+95.
[6]王锐.章太炎晚年学术思想研究[D].华中师范大学,专门史,2013,硕士.
[7]徐曙晓.基于关联理论的英文商业广告中的隐喻翻译研究[D].宁波大学,英语笔译（专业学位）,2014,硕士.
[8]张雷仝.行政强制的救济制度研究[D].南京航空航天大学,宪法学与行政法学,2013,硕士.
[9]耿超.创业网络治理机制对新企业绩效的影响作用研究[D].天津财经大学,企业管理,2012,硕士.
[10]王源宏.基于意见挖掘的协同过滤系统[D].山东大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[11]石艳.费孝通家庭社会学思想研究[D].上海大学,社会学,2013,博士.
[12]韩立东.矿相匹配对再生水泥熟料烧成与性能的影响[D].大连理工大学,材料学,2013,硕士.
[13]陈聚峰.Dirichlet级数与随机Dirichlet级数的增长性[D].华南师范大学,应用数学,2004,硕士.
[14]肖锐.人类活动影响下流域土壤及植被的时空格局变化[D].浙江大学,农业遥感与信息技术,2014,博士.
[15]孙红国.基于代谢组学的当归补血作用研究[D].甘肃农业大学,临床兽医学,2013,硕士.
[16]苗利利.含2，6-二（1-氢-3-吡唑）吡啶金属配合物的合成、结构与催化性能研究[D].苏州大学,无机化学,2012,硕士.
[17]陈博.软坚散结配方对颈动脉粥样硬化斑块干预作用机制的研究[D].湖北中医药大学,中医内科学,2014,博士.
[18]孙岳.风洞性能测试以及两个非平行圆柱尾流区的研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[19]韩睿.论企业如何成功开展CRM[J].科技和产业,2004,10:45-49.
[20]贺志平.高性能二氧化钛光催化剂的合成与表征[D].吉林大学,无机化学,2013,硕士.
[21]刘姝.中日韩三国沿海城市填海造地战略研究与分析[D].大连理工大学,城市规划与设计,2013,硕士.
[22]熊国徽.基于极限分析的大跨度斜拉桥安全评定与预警[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2013,硕士.
[23]马轮.藏北雁石坪地区中—晚侏罗世沉积地层古地磁学研究[D].西北大学,矿产普查与勘探,2013,硕士.
[24]杰克.瑞典电力产能综合资源战略规划[D].清华大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[25]李和平.含铋金属氧化物的制备及光催化性能研究[D].燕山大学,化学工艺,2014,硕士.
[26]李建平,徐伟宣,石勇.数据挖掘技术中的线性方法[A].中国优选法统筹法与经济数学研究会、中国科学院科技政策与管理科学研究所.2002年中国管理科学学术会议论文集[C].中国优选法统筹法与经济数学研究会、中国科学院科技政策与管理科学研究所:,2002:3.
[27]张忠英.非营利组织营销问题研究[D].吉林大学,企业管理,2004,硕士.
[28]陈曦.矿用汽车油气悬架的特性研究[D].西南交通大学,机械电子工程,2013,硕士.
[29]苟小丽.检测外周血CEA、CA125、VEGF、MT及MMP-9的表达与非小细胞肺癌病理类型和临床分期的相关性研究[D].遵义医学院,内科学（专业学位）,2012,硕士.
[30]王东寅.小模数高速数控滚齿机的研究[D].河南科技大学,机械制造及其自动化,2014,硕士.
[31]王胜.振动频率分析仪的设计与实现[D].浙江工业大学,2013.
[32]杨爱锋.我国应对国际税收竞争研究[D].东北财经大学,财政学,2012,硕士.
[33]刘锐.高校思政理论课多媒体课件设计理论与实践[D].浙江工业大学,2013.
[34]徐秀明.世界背景下的中国心理小说[D].苏州大学,中国现当代文学,2003,硕士.
[35]凌志泉.Web日志挖掘技术的研究与自适应Web站点的构建[D].天津大学,2003.
[36]黄兵.面向应用原型开发的CAN网络仿真研究[D].湖南大学,计算机科学与技术,2012,硕士.
[37]喻小燕.从“灵魂戏剧”看中西文化的差异[D].海南大学,比较文学与世界文学,2014,硕士.
[38]贺超.外包U型钢—混凝土组合梁抗弯性能研究[D].哈尔滨工业大学,结构工程,2014,硕士.
[39]徐洪涛,王跃钢,邓卫强.基于自组织神经网络的非平稳信号盲分离[J].控制与决策,2011,05:748-752.
[40]孙乾.桂芍知母汤对类风湿关节炎模型鼠滑膜组织血管内皮生长因子影响[D].辽宁中医药大学,中西医结合临床,2012,硕士.
[41]王明新,呙虎.一种背靠背直流输电系统换流变压器分接开关控制[J].电力系统自动化,2010,06:61-64+78.
[42]李劲君,张爱民,张杭.一种应用于数字化变电站的嵌入式TCP/IP协议栈[J].电力系统自动化,2010,10:97-100.
[43]索永利.铁路货运电子商务数据交换基础标准研究[D].西南交通大学,交通运输规划与管理,2014,硕士.
[44]张伟.基于DSP和FPGA的形态学骨架提取硬件实现技术研究[D].南京航空航天大学,测试计量技术及仪器,2004,硕士.
[45]任海荣.论科技成果转化中政府的作用[D].太原科技大学,科学技术哲学,2014,硕士.
[46]闫宏.论上市公司收购中中小股东权益的保护[D].河北经贸大学,法律,2014,硕士.
[47]沈陈镱.量子算法的设计研究及应用[D].华东交通大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[48]MOHAMMADReza-Davoodi,HAMIDReza-Momeni,ABDOLKARIMDaryabor.减少离散大系统两级镇定控制的保守性(英文)[J].自动化学报,2010,02:322-327.
[49]王帅.论宗教与法律的关系[D].中国社会科学院研究生院,传媒法（专业学位）,2014,硕士.
[50]天源证券、方正证券研究员王参合　程荣庆.概念主导基金缺席科技股“虚”怀若谷[N].证券时报,2013-03-15A14.