Cu~(2+)对苏云金芽胞杆菌X022新菌株毒蛋白产量及杀虫活性的影响

【摘要】苏云金芽胞杆菌(Bacillusthuringiensis,Bt)X022是从土壤中分离筛选到的一株产菱形伴胞晶体的菌株,经形态特征镜检和16SrRNA基因鉴定,初步确定属于苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种。SDS-PAGE检测显示BtX022菌株晶体蛋白分子量大约为130kDa。采用二维液质联用质谱仪(2D-LC-MS/MS)分析BtX022菌株的芽胞释放期全菌体蛋白,鉴定到该菌株表达Cry1Ca、CrylAc和Cry1Da等毒蛋白。利用刘飞等优化的Bt4.0718菌株的原培养基配方,进一步改进初始pH值、改善溶氧条件和添加适量Cu2+,使BtX022菌株的130kDa毒蛋白产量得到了提高。SDS-PAGE结合生物医学实验专用影像分析软件MiBio分析显示,10-6mol/L的Cu2+使BtX022菌株的130kDa晶体蛋白产量提高了21%左右,且最适合BtX022菌株晶体蛋白产生的Cu2+浓度范围为10-6-10-4mol/L.毒素蛋白emPAI值半定量和qRT-PCR分析显示,Cu2+主要提高了Cry1Da和Cry1Ca的表达量。毒力生测结果显示,培养基中添加微量Cu2+显著增强了BtX022菌株发酵液对甜菜夜蛾和棉铃虫幼虫的杀虫活性。检测Cu2+对BtX022菌株发酵过程的生长曲线、pH变化和葡萄糖消耗的影响,结果显示Cu2+使BtX022菌株稳定期延长、衰亡期菌体裂解加速；发酵过程pH回升加快、平台期pH值降低且平台期持续时间长；葡糖糖消耗情况无差异。为了进一步探索Cu2+提高BtX022新菌株毒蛋白产量及杀虫活性的机制,对原培养基和添加Cu2+培养基中芽胞释放期的BtX022菌体全蛋白进行了2D-LC-MS/MS检测,蛋白功能分类及表达谱的比较分析显示Cu2+使环境信息加工过程蛋白和聚糖合成与代谢蛋白表达下调；emPAI1(?)半定量结合qRT-PCR分析发现Cu2+使PhaR、BDH、EF-G、KASIⅡALDH等一些功能蛋白表达上调。综合分析Cu2+引起的发酵参数改变(稳定期延长、菌体裂解加速,pH回升加快)以及蛋白质组学变化,推测适量的Cu2+通过增加菌体内PhaR的表达量改变了BtX022菌株的碳源流向：环境信息加工过程蛋白和聚糖合成与代谢蛋白表达下调,导致胞外多糖生物合成减少,从而菌体裂解加快；更多碳源用于合成胞内PHB,PHB储存物的增加使BtX022菌株稳定期延长、pH回升加快,且稳定期可释放更多能量用于蛋白的翻译,最终增加了杀虫晶体蛋白的产量。
【作者】刘雪梅；
【导师】丁学知；
【作者基本信息】湖南师范大学，微生物学，2014，硕士
【关键词】苏云金芽胞杆菌；Cu2+；杀虫晶体蛋白；杀虫毒力生测；2D-LC-MS/MS；RT-qPCR；PhaR；

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