蛋白磷酸酶-1cγ在鱼类胚胎发育中的功能研究

【摘要】蛋白质的可逆磷酸化作用对于许多生物的生长发育起着至关重要的调控作用,其中蛋白激酶和蛋白磷酸酶分别起着磷酸化和去磷酸化作用,蛋白磷酸酶-1(PP-1)是一种广泛存在于真核细胞内的蛋白磷酸酶,它能够将丝/苏氨酸蛋白底物去磷酸化。在本论文中,我们将重点研究和阐述PP-1的催化亚基C的异构体γ(Gama)基因(PP-1cy)在动物胚胎的生长发育过程中的功能与作用。首先,我们运用RACE克隆技术在金鱼中克隆出丫基因的cDNA全长；然后,运用RT-PCR技术检测γ基因在金鱼不同胚胎发育时期和不同组织中]mRNA水平的表达；最后,在金鱼受精卵中注射PP-1Cγ的MorpholinoOligomers(MO)或过表达PP-1cγ的质粒载体,以此来分析研究PP-1cy在金鱼的胚胎发育中所扮演的功能角色。具体研究结果如下：(1)金鱼中PP-1cy基因的的cDNA全长为1078bp,其中编码区972bp,编码一种含323个氨基酸的蛋白质。PP-1cγ蛋白的氨基酸序列进行不同物种同源性比对结果表明：该蛋白序列与斑马鱼的同源相似度为96.9%,与小鼠的为96.5%,与人的为96.5%。该结果表明了PP-1cγ的氨基酸序列在不同物种间具有较高的同源性,暗示了该基因在功能和进化上具有较高的保守性,同时说明PP1-cγ基因在功能上的至关重要性。(2)半定量PCR结果显示,在金鱼的9种组织和12个不同胚胎发育时期中的表达量各不相同。其中,在12个不同胚胎发育时期中,PP-1cγ在眼色素期表达最强,囊胚期和出膜期次之,视原基期、心跳期、脑泡期表达较高,多细胞期、神经胚期、原肠期、肌效期以及体色素期表达较低,两细胞期表达最低。在9种不同组织中,PP-1cγ在卵巢中表达量最高,心脏和鳃次之,在精巢、肌肉、鳍、脑四种组织中的表达水平相对较高,在肾、肝组织中的mRNA表达表达量较少。(3)显微注射结果表明,注射了PP1-Cγ的MO和过表达质粒的金鱼胚胎均产生了严重畸形或死亡,如胚胎的脊柱弯曲、眼睛发育异常以及大脑发育畸形等。这说明PP-1cγ基因在胚胎发育过程中起着重要的调控作用。进一步对注射了过表达质粒的眼睛异常的金鱼胚胎进行石蜡切片。结果显示,金鱼的眼睛发育出现异常,出现大眼或小眼,晶状体缺失或畸形,视网膜发育畸形等表型。这表明PP-1cγ对眼睛的发育至关重要。上述结果为我们进一步研究PP-1cγ基因在其他脊椎动物中的相关功能奠定了扎实的基础。
【作者】张绪文；
【导师】刘文彬；
【作者基本信息】湖南师范大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】PP-1；PP-1cγ；RACE克隆；显微注射；胚胎发育；

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