秀丽线虫反转座基因ssp-31的表达和功能分析

【摘要】基因重复(geneduplication)是新基因形成的重要机制,在遗传进化和生物演化中发挥着重要的作用,其中由RNA介导的基因重复形成的反转座基因(retrocopy)通常被认为是无功能的,但近来的相关研究在果蝇、斑马鱼及一些哺乳动物和植物等的基因组中都已筛选出大量有功能的反转座基因,并且其中一些基因的功能已经通过实验得到证实。秀丽线虫(Caenorhabditiselegans)是多细胞动物中第一个被测定全基因组序列的生物,现已成为发育生物学、神经生物学、细胞凋亡、疾病与衰老等研究领域的模式生物,也是研究比较基因组学及系统演化的理想实验材料,但其反转座基因的研究尚处于起步阶段。2012年Zou等对秀丽线虫基因组中的反转座基因进行筛选共发现43个反转座基因(如ssp-31),根据公共表达数据库以及RT-PCR实验的结果推测其中大部分反转座基因都可以表达,且可能具有一定的功能,但尚未通过实验对其在线虫不同发育期的表达量差异及生物学功能进行分析和验证。本实验根据反转座基因可表达、dN/dS小于0.5、p值小于0.01的标准以及本实验室的研究方向(线虫的生殖发育),最终选择了秀丽线虫反转座基因ssp-31进行研究,该基因隶属于精子特异性蛋白(SSP)家族,该家族共有12个成员。根据wormbase网站公布的对SSP家族成员的RNA干扰实验结果和脂肪代谢与线虫生殖发育关联性的研究,推测反转座基因ssp-31可能在线虫的脂肪代谢、生长发育以及生殖能力等方面具有一定功能性,但目前对于反转座基因ssp-31功能的相关研究尚属空白。本文是首次对秀丽线虫反转座基因sssp-31的表达和功能进行初步研究。首先利用RT-PCR技术扩增出ssp-31基因331bp的片段,以确定该基因可以表达,并利用荧光定量PCR技术对该基因在秀丽线虫生长发育不同时期(卵、L3、L4及成虫)的表达量进行了分析。结果表明ssp-31基因在卵及成虫期的表达量较高,在L3和L4期的表达量则较低,且存在显著性差异(p<0.05),故推测该基因属于母源性基因,可能在线虫的产卵行为等方面起作用。进一步采用RNA干扰技术,对ssp-31基因的生物学功能进行研究。实验首先克隆了长度331bp的ssp-31基因片段,并在测序后将其与线虫RNA干扰表达载体L4440进行连接,成功构建出重组干扰载体L4440-ssp-31；然后将重组载体转化入大肠杆菌HT115感受态细胞,利用IPTG诱导dsRNA的表达,通过喂食的方法使秀丽线虫的ssp-31基因沉默,并获得了较好的干扰效果。结果发现该基因沉默的线虫主要出现如下现象：(1)线虫产卵总量由对照组的278±7降低到255±8(p<0.05),但卵的孵化率由对照组的78.5±1.5%增高到97.8±0.9%(p<0.001),因此总的子代数则由对照组的219±11增加到249±8(p<0.05)；(2)产卵周期由对照组的6-8天缩短至5天；(3)第一天和第二天产卵量由对照组的8±5和60±6分别增高到33±5(p<0.01)和92±7(p<0.01),第四天和第五天的产卵量则由对照组的81±2和37±5分别降低到31±110<0.01)和3±3(p<0.001)；(4)产卵高峰期缩短,由对照组的3天(第2、3、4天)缩短为2天(第2、3天)；(5)对秀丽线虫体内脂肪进行染色并进行图片灰度分析发现,干扰组线虫体内脂肪含量有极显著性的增加(p<0.001)；(6)秀丽线虫在身体形态、运动、卵及幼虫生长发育等方面无异常。以上实验结果表明ssp-31基因沉默后产卵量下降,卵孵化率增高,从而表现出子代数量显著增加的特征。线虫通过缩短产卵周期和产卵高峰期来显著地降低线虫的产卵总量,这可能是由于多不饱和脂肪酸PUFA的含量过多引起的；线虫子代数量的显著增加则可能是因为ssp-31基因参与调控其他脂代谢相关基因的表达量(与nhr-64基因相似),也可能是因为线虫体内PUFA含量的增加增强了线虫精子的定向运动能力而最终导致孵化率增高(与fat-2、fat-3突变体相似)。综上所述,本研究证实秀丽线虫反转座基因ssp-31在调控秀丽线虫的脂肪代谢以及生殖能力方面有一定的功能。
【作者】赵斐；
【导师】王国秀；
【作者基本信息】华中师范大学，动物学，2014，硕士
【关键词】秀丽线虫；反转座基因；ssp-31；荧光定量；RNA干扰；

【参考文献】
[1]林帅.石墨烯基金属及金属氧化物复合吸波材料的制备及其性能研究[D].北京化工大学,化学,2013,硕士.
[2]赵善焕.CFETR中心螺线管线圈结构设计和电磁分析[D].中国科学技术大学,核能科学与工程,2014,硕士.
[3]陈兆宽,陈辉.控制幅值受限下定常离散线性系统最小拍控制序列的一种综合方法[J].自动化学报,1995,05:570-577.
[4]向隅.农业产业化组织形式的比较研究[D].合肥工业大学,产业经济学,2004,硕士.
[5]田翠华.宜昌丝竹的传承现状与保护研究[D].中南民族大学,民俗学,2013,硕士.
[6]向斌.西部中小企业欠发展的一个解释——社会化服务体系的发育[D].中央民族大学,中国少数民族经济,2004,硕士.
[7]李文梅.维生素B12对宫内发育迟缓大鼠脑损伤的干预研究[D].苏州大学,儿科学（专业学位）,2014,硕士.
[8]曹益瑰.中原经济区城乡统筹发展测度研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2013,硕士.
[9]古那儿·托乎提.乌鲁木齐市维吾尔族初中生英语学习现状调查研究[D].新疆师范大学,中国少数民族语言文学,2014,硕士.
[10]迟鹏利.5-氨基酮戊酸盐酸盐和曲沙他滨的合成研究[D].山东大学,有机化学,2013,硕士.
[11]陈彦琪.三网融合中的文本内容流识别系统研究[D].华中科技大学,软件工程,2013,硕士.
[12]平丽新.混沌系统的追踪控制研究[D].东北师范大学,电路与系统,2012,硕士.
[13]邓飞其,冯昭枢,刘永清.随机系统的变结构控制[J].自动化学报,1997,02:125-128.
[14]罗文峰.岳阳市财政支农问题研究[D].湖南农业大学,农村与区域发展,2012,硕士.
[15]王锡魁.基于IEC61850标准的故障选线装置模型研究[D].燕山大学,电力系统及其自动化,2014,硕士.
[16]徐斌.我国通货膨胀率对股票收益率影响研究[D].宁波大学,数量经济学,2014,硕士.
[17]丁利琼.基于陶瓷的无线无源高温压力与温度传感器的设计、制备及测试[D].中北大学,测试计量技术及仪器,2014,硕士.
[18]温伯寅.以房养老需求倾向和意愿研究[D].河北经贸大学,社会保障,2012,硕士.
[19]宁艳杰.黑河第一人民医院电子病历管理系统设计与实现[D].吉林大学,软件工程,2013,硕士.
[20]卿济民,綦炘.高速线材精轧线速度的微机检测与同步显示[J].冶金自动化,1995,05:15-19.
[21]吴可慧.不同任务难度及刺激时长对基于物体和基于空间的西蒙效应的影响[D].苏州大学,应用心理（专业学位）,2014,硕士.
[22]刘丽丽.Adomian分解法和Legendre小波求解非线性分数阶积分微分方程[D].燕山大学,计算数学,2013,硕士.
[23]李晓峰,孙林夫.分销网络信息管理系统研究与设计[J].中国制造业信息化,2004,01:74-75+86.
[24]郭芮.审判委员会制度研究[D].吉林大学,法律,2012,硕士.
[25]高春如,张金水,赵旭东,沈俭.高压电动机负序过电流保护整定计算[J].电力系统自动化,2011,15:93-97.
[26]梁才林.梁漱溟乡村建设运动（及理论）研究[D].中国社会科学院研究生院,社会组织管理（专业学位）,2014,硕士.
[27]陈书练.经皮肾镜取石术后尿源性脓毒症的危险因素分析[D].遵义医学院,泌尿外科（专业学位）,2014,硕士.
[28]陈军能.WORM型含芴功能高分子信息存储材料的设计和制备[D].华东理工大学,2013.
[29]秦国庆.光纤捷联航姿系统高精度姿态解算及性能优化技术研究[D].南京航空航天大学,导航、制导与控制,2012,硕士.
[30]孔繁越.基于简化模型分析岩石第Ⅱ类曲线[J].山西建筑,2014,07:70-72.
[31]赵玲.电喷发动机诊断与维修信息系统开发与研究[D].河南农业大学,农业机械化工程,2004,硕士.
[32]赵世超.改性粉煤灰合成沸石分子筛及其吸附性能的研究[D].北京交通大学,光学工程（专业学位）,2013,硕士.
[33]朱泓.古典与民族的融合[D].华东师范大学,文学（专业学位）,2013,硕士.
[34]李鹏.TiO_2光催化复合氧化法处理电镀添加剂生产废水的工程化实验研究[D].广东工业大学,环境工程,2013,硕士.
[35]唐荣华.Nell-1在小鼠牙胚发育及人牙髓牙本质复合体中表达的免疫组化研究[D].山东大学,口腔临床医学（专业学位）,2013,硕士.
[36]杨磊.商品房按揭风险法律防范研究[D].贵州民族大学,经济法学,2012,硕士.
[37]艾恕.迅速崛起的亚太光纤市场[J].世界电信.1995(02)
[38]夏曙东,承继成.数字王府井的建设研究[J].智能建筑与城市信息,2003,02:23-25+22.
[39]杨蕴文.英文犯罪新闻的及物性分析[D].河北师范大学,英语语言文学,2004,硕士.
[40]刘艳霞.不同转型模式下的资源型企业可持续发展能力评价[D].内蒙古大学,会计学,2014,硕士.
[41]康长杰,T.H.Lee.适应控制综述[J].自动化学报,1992,03:257-265.
[42]栾姗姗.现代汉语“一点+VP”结构研究[D].吉林大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[43]易俗.不同共情能力与群体恐慌情境对恐惧视频材料认知评价的影响[D].湖南师范大学,应用心理学,2013,硕士.
[44]岳艳利.大孔聚氨酯载体固定化微生物及其污水处理研究[D].兰州大学,环境工程,2013,硕士.
[45]成建国.鄂钢380m~3高炉供上料系统设计[J].炼铁.1999(06)
[46]李德昌.对称化教育和对称化素质——势科学视角下的人才竞争战略[J].教育理论与实践,2012,34:3-6.
[47]李茜.犹太流亡戏剧在上海：1939-1947[D].北京大学,比较文学与世界文学,2013,硕士.
[48]王倩.非营利组织参与城市社区养老保障研究[D].山东财经大学,社会保障学,2012,硕士.
[49]王晓龙.基于关联规则属性约简的树增广朴素贝叶斯分类器及应用[D].吉林大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[50]王月娥.工商银行兴顺支行信用风险管理问题研究[D].东北大学,工商管理,2009,硕士.