新型抗抑郁中药舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠的作用机制研究

【摘要】第一部分舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠行为学的影响目的：舒肝解郁胶囊是由贯叶金丝桃和刺五加两味中药组成的中药复方制剂,是国家食品药品管理局于2008年批准的第一个用于临床治疗轻中度抑郁症的中药。本研究观察舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠行为学的影响,从行为学角度阐述舒肝解郁胶囊的抗抑郁作用。方法：将80只成年雄性SD大鼠随机分为二批：每批40只,每批大鼠又随机分为4组：正常对照组(Control,C组)；模型组(Model,M组)；舒肝解郁组(Shuganjieyu,S组)；氟西汀组(Fluoxetine,F组),每组10只。C组：不给予应激刺激,每日在应激组灌服药物的同时间段灌服0.5%的羧甲基纤维素纳悬浮液10ml/kg.d;M、S和F组大鼠均采用孤养并接受21天各种不同的轻度不可预知性应激刺激,同时在应激前30分钟分别灌注0.5%的羧甲基纤维素纳悬浮液10ml/Kg.d、舒肝解郁胶囊悬浮液150mg/Kg.d和氟西汀悬浮液1.54mg/Kg.d,每日1次。建模完成后,第一批大鼠用于旷场、糖水消耗和强迫游泳试验,第二批大鼠用于水迷宫测试,来检测大鼠的抑郁样行为。结果：在旷场试验中,建模前各组大鼠的自发活动总路程比较无显著差异(p>0.05)。建模后模型组大鼠自发活动总路程与正常对照组比较显著缩短(116.58±24.93vs487.36±139.42,P<0.01)；与氟西汀组一样,舒肝解郁组大鼠自发活动总路程较模型组显著增加(392.15±103.65,433.02±117.70vs116.58±24.93,bothP<0.05),舒肝解郁组与氟西汀组间比较无显著性差异(392.15±103.65vs433.02±117.70,p>0.05)。建模前各组大鼠的总液体消耗量、糖水消耗量及糖水偏爱百分比均无显著性差异(p>0.05)。建模后各组大鼠总液体消耗量无显著性差异(p>0.05)；但模型组大鼠较正常对照组糖水消耗量和糖水偏爱百分比显著降低(7.9±0.9vs12.8±1.31,P<0.05；50.97±2.52vs70.16±4.05,P<0.01)；与模型组相比,舒肝解郁胶囊干预后抑郁大鼠的糖水消耗量和糖水偏爱百分比显著增加(11.8±1.36vs7.9±0.9；63.21±2.25vs50.97±2.52,P<0.05)；与正常对照组比较无显著性差异(p>0.05)。建模后模型组大鼠较正常对照组大鼠的强迫游泳不动时间显著延长(138.4±18.96vs90.20±10.20,P<0.05)；与模型组相比,舒肝解郁胶囊组和氟西汀组大鼠的强迫游泳不动时间显著缩短(138.4±18.96vs78.30±9.94,79.80±10.05,P<0.01)；舒肝解郁组与正常对照组比较无显著性差异(p>0.05)。在Morris水迷宫测试中,建模前后各组大鼠的逃避潜伏期、目标象限停留的时间、穿越平台次数的比较均无显著性差异(p>0.05)。结论：①采用CUMS结合孤养建立的抑郁动物模型,是理想的慢性应激抑郁动物模型。②舒肝解郁胶囊治疗能显著改善抑郁动物模型的抑郁症状,其疗效与氟西汀大致相当。第二部分舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠内侧前额叶皮质和海马CA3区p-CREB和BDNF表达的影响目的：舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠内侧前额叶皮质(medialprefrontalcortex,mPFC)和海马CA3区磷酸化的cAMP反应元件结合蛋白(phosphorylatedmonophosphateresponseelementbindingprotein,p-CREB)及脑源性神经营养因子(Brain-DerivedNeurotrophicFactor,BDNF)表达的影响,来探讨舒肝解郁胶囊抗抑郁症的可能作用机制。方法：将雄性SD大鼠24只随机分成正常对照组(Control,C组)、模型组(Model,M组)、舒肝解郁组(Shuganjieyu,S组)、氟西汀组(Fluoxetine,F组)4组,每组6只,采用慢性轻度不可预知性应激(chronicunpredictablemildstress,CUMS)结合孤养建立抑郁大鼠模型,舒肝解郁组和氟西汀组大鼠于建模同时分别灌服舒肝解郁胶囊(150mg/Kg.d)和氟西汀(1.54mg/Kg.d)干预,正常对照组和模型组大鼠于建模同时分别灌服0.5%的羧甲基纤维素纳悬浮10nl/Kg.d。建模完成后,采用免疫组化检测大鼠mPFC和海马CA3区的p-CREB和BDNF蛋白的表达,并使用Motic病理图像分析系统分析上述脑区阳性神经元内的p-CREB和BDNF蛋白平均灰度值。灰度值相对定量地反应出阳性区域p-CREB和BDNF蛋白表达强弱的变化,其强弱与灰度值呈反比,即灰度值越大,p-CREB和BDNF蛋白表达越弱,反之亦然。结果：建模21天后,p-CREB和BDNF蛋白表达免疫组织化学阳性细胞在光镜下呈棕黄色,p-CREB蛋白主要分布细胞核内,而BDNF蛋白主要分布在细胞的胞浆内。与对照组相比,模型组大鼠mPFC和海马CA3区p-CREB和BDNF的平均灰度值均显著增加(P<0.05)；舒肝解郁组和氟西汀组大鼠mPFC和海马CA3区的p-CREB和BDNF蛋白的平均灰度值较模型组显著减少(P<0.05),两药物组大鼠mPFC区的p-CREB蛋白平均灰度值分别是173士16.8,167.1士14.7vs226.4士13.3(P<0.05)和海马CA3区的p-CREB蛋白平均灰度值分别是188.4士13.2,186.9士14.4vs233.5士13.5(P<0.05)；同时mPFC区的BDNF蛋白平均灰度值分别是177.44-12.5,181.8士11.6vs222.6±11.7(P<0.05),海马CA3区的p-CREB平均灰度值分别是168.7±15.7,161.9±15.2vs223.2±14.3(P<0.05)。两药物组间比较无显著性差异(P>0.05)。结论：舒肝解郁胶囊能够显著增加慢性应激抑郁大鼠mPFC和海马CA3区p-CREB和BDNF的表达,可能是其抗抑郁作用的机制之一。第三部分舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠海马神经元凋亡及脑内caspase-3蛋白表达的影响目的：研究舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠海马神经元凋亡及脑内caspase-3蛋白表达的影响,来探讨舒肝解郁胶囊治疗抑郁症的可能作用机制。方法：将雄性SD大鼠24只随机分成正常对照组(Control,C组)、模型组(Model,M组)、舒肝解郁组(Shuganjieyu,S组)、氟西汀组(Fluoxetine,F组)4组,每组6只,采用CUMS结合孤养建立抑郁大鼠模型,舒肝解郁组和氟西汀组大鼠于建模同时分别灌服舒肝解郁胶囊(150mg/Kg.d)和氟西汀(1.54mg/Kg.d)干预。正常对照组和模型组大鼠于建模同时分别灌服0.5%的羧甲基纤维素纳悬浮10ml/Kg.d;采用Nissle染色和TUNEL染色方法分别观察大鼠海马CA3区神经元形态结构和神经元细胞凋亡,应用免疫印迹分析检测大鼠mPFC和海马CA3区caspase-3蛋白表达。结果：建模21天后,与正常对照组比较,模型组大鼠海马CA3区细胞结构破坏显著,凋亡实验发现,大鼠海马CA3区TUNEL阳性细胞数比较,模型组较正常对照组显著增加(62.5±4.8vs8.8±1.0,P<0.01),而舒肝解郁组(17.7±2.9)和氟西汀组(14.2±2.1)较模型组显著减少(P<0.01),与正常对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)；舒肝解郁组与氟西汀组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。与正常对照组比较,模型组大鼠mPFC和海马CA3区caspase-3蛋白表达显著增加(p<0.05)；与模型组比较,经舒肝解郁干预的大鼠海马CA3区细胞结构破坏显著改善,凋亡细胞数及脑mPFC和海马CA3区caspase-3蛋白表达均显著减少(p<0.05),与氟西汀组和正常对照组比较均无统计学意义(p>0.05)。结论：舒肝解郁胶囊能显著改善抑郁模型大鼠的抑郁症状,促进抑郁大鼠海马CA3区神经细胞损伤的修复和／或新生,其机制可能与抑制神经细胞外Ca2+大量内流,阻止Ca2+超载,下调脑内caspase-3蛋白表达相关。关键词：舒肝解郁胶囊；抑郁症；caspase-3;细胞凋亡；蛋白印迹第四部分：舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠中枢神经递质的影响目的：分析舒肝解郁胶囊对抑郁模型大鼠脑组织中多巴胺(dopamine,DA)、5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)、谷氨酸(glutamate,Glu)和Y-氨基丁酸(gamma-aminobutyricacid,GABA)及相关代谢产物浓度的影响,探讨舒肝解郁胶囊抗抑郁的神经生化机制。方法：将28只雄性SD大鼠随机分成正常对照组、模型组、舒肝解郁组和氟西汀组4组,每组7只。采用CUMS结合孤养建立抑郁大鼠模型,建模完成后于冰面取脑并分离内侧前额皮质(medialprefrontalcortex,mPFC)和海马,采用库仑阵列-电化学高效液相色谱法测定上述脑区DA、5-HT、G1u和GABA及相关代谢产物的浓度。结果：①与正常对照组比较,模型组大鼠mPFC区和海马组织中DA、5-HT及5-HIAA的浓度均显著降低(P<0.05),mPFC区的HVA浓度显著降低(P<0.01)；与模型组比较,氟西汀组和舒肝解郁组大鼠上述脑区的DA和5-HT浓度均显著升高(P<0.05),两组大鼠mPFC区的HVA显著升高(P<0.05),海马区5-HIAA显著升高(P<0.05)；舒肝解郁组与氟西汀组比较,两脑区各递质浓度均无显著性差异(P>0.05)。②与正常对照组比较,模型组大鼠mPFC及海马组织中Glu的浓度均显著升高(p<0.01),GABA浓度均显著降低(p<0.05)；与模型组比较,氟西汀组和舒肝解郁组大鼠mPFC区及海马组织中Glu的浓度均显著降低(P<0.05),氟西汀组大鼠上述脑区GABA浓度均显著升高(p<0.01)；但舒肝解郁组大鼠mPFC区GABA浓度无显著性差异(p>0.05),海马GABA浓度显著升高(p<0.01).结论：①抑郁模型大鼠mPFC和海马组织DA及5-HT递质系统功能减弱退；舒肝解郁胶囊或氟西汀治疗可增强CUMS结合孤养抑郁模型大鼠上述脑区DA和5-HT递质系统的功能；②抑郁模型大鼠mPFC和海马Glu递质系统的功能亢进,GABA递质系统功能减退；舒肝解郁胶囊或氟西汀治疗可下调抑郁模型大鼠上述脑区Glu递质系统功能亢进；增强部分脑区GABA递质系统功能；③舒肝解郁胶囊和氟西汀治疗可改善抑郁模型大鼠mPFC和海马组织DA、5-HT、Glu及GABA递质系统功能,通过重新调节上述神经递质水平而达到抗抑郁作用。
【作者】傅锦华；
【导师】赵靖平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】舒肝解郁胶囊；抑郁症；行为学；动物模型；mPFC；海马CA3区；p-CREB；BDNF；库仑阵列电化学检测；DA；DOPAC；5-HT；HVA；5-HIAA；Glu；GABA；

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