以MEF2为靶点的小分子化合物CC1007在体外实验和裸鼠模型中的抗肝癌作用

【摘要】第一章CC1007对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响和体内抗肿瘤活性目的：研究CC1007对肝癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响和体内抗肿瘤活性。方法：以不同浓度的CC1007干预肝癌细胞和成纤维细胞一定时间,采用MTT法分析细胞增殖或存活；流式细胞术检测细胞周期分布；利用Hoechst染色及流式细胞仪(AnnexinV/PI双染法)检测细胞凋亡；裸鼠皮下成瘤实验检测CC1007体内的抗肝癌作用。结果：1.CC1007呈时间和浓度依赖的抑制各组肝癌细胞生存率(各组间比较P<0.05)。40μM的CC1007干预72h后,HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7细胞的存活率分别为(8.2±4.04)%、(2.3±1.78)%、(12.5±7.25)%、(6.6±5.03)%,而成纤维细胞的生存率为(61.1±4.19)%(与各肝癌细胞比较,P<0.05)；CC1007干预72h,HepG2、PLC/PRF、Huh7、Hep3B细胞以及皮肤成纤维细胞的IC50分别为27.1μM、2.6μM、12.12μM、5.6和>40μM。2.CC1007干预24h后,HepG2细胞G0/G1期细胞比例升高、S期细胞比例下降。对照组(1‰DMSO)、10μM、20μM及40μM组G0/G1期细胞比例分别为61.1%、79.4%、80.2%、77.8%,S期细胞比例分别为28.5%、12.1%、12.6%、19.3%。3.Hoechst33258染色结果显示CC1007干预HepG2细胞48h后,HepG2细胞核呈现典型的凋亡形态改变。AnnexinV/PI双染法检测胞凋亡结果显示CC1007干预48h后,细胞凋亡率随着浓度而升高,40μMCC1007干预48h后,HepG2、PLC/PRF/5、Huh7、Hep3B细胞的凋亡率分别为(41.43±1.7)%(与对照组比较,P<0.05)、(70.46±10.48)%(与对照组比较,P<0.05)和(23.63±2.68)%(与对照组比较,P<0.05)、(20.23±2.97)%(与对照组比较,P<0.05)。4.50mg/kg/d的CC1007对裸鼠皮下移植瘤体积的抑制率为55.4%(n=5,P<0.05),而对小鼠体重没有影响。结论：1.CC1007对肝癌细胞具有选择性抑制作用,CC1007呈浓度和时间依赖性的降低肝癌细胞存活率,而成纤维细胞对CC1007的耐受性高于肿瘤细胞。2.CC1007阻滞HepG2细胞周期于G0/G1期；10μM浓度的CC1007即能有效地阻滞细胞周期。3.CC1007能够诱导肝癌细胞凋亡。4.CC1007能够抑制裸鼠肝癌移植瘤的生长。第二章CC1007抗肝癌机制的初步探讨目的：初步探讨CC1007抗肝癌的作用机制方法：CC1007干预肝癌细胞一定时间后,采用Westrenblot法检测乙酰化H3(Ace-H3)、乙酰化H4(Ace-H4);RT-PCR、Westrenblot法检测周期抑制蛋白p21的表达；RT-PCR、Westrenblot法检测Nur77的表达；Caspase3/7assay及Westrenblot检测Caspase的活化。结果：1.CC1007干预肝癌细胞24h后,HepG2、PLC/PRF/5、Hep3B、Huh7细胞的Ace-H3、Ace-H4表达均增加。2.CC1007干预肝癌细胞后,HepG2细胞p21的mRNA和蛋白表达量都增加。3.不同浓度CC1007干预肝癌细胞30h后,Caspase3/7assay发现HepG2、PLC/PRF/5细胞的Caspase3/7被激活,进一步的Westrenblot检测发现Caspase9和Caspase3被活化,而Caspase8没有被激活。4.CC1007干预肝癌细胞20h后,RT-PCR显示Nur77mRNA表达升高；干预24h小时后Westrenblot显示Nur77蛋白表达升高。结论：1.CC1007能够诱导肝癌细胞组蛋白乙酰化水平增加。2.CC1007诱导p2l表达增加可能参与细胞周期阻滞。3.CC1007激活内源性凋亡通路。4.CC1007诱导凋亡相关因子Nur77的表达。第三章Nur77在CC1007诱导肝癌细胞凋亡中的作用目的：探讨Nur77在CC1007诱导肝癌细胞凋亡中的作用方法：CC1007干预HepG2细胞一定时间后,采用免疫荧光法激光共聚焦检测Nur77在细胞内的定位变化；采用westernblot检测Nur77在胞浆和胞核的表达变化；建立稳定干扰Nur77的HepG2细胞株,采用MTT法检测细胞存活率、hoechst染色计数凋亡细胞比例、流式细胞仪检测SubG1期细胞比例。结果：1.免疫荧光激光共聚焦显示40μM的CC1007干预24h后,HepG2细胞中Nur77表达量升高,浓聚于细胞核：干扰30h后,Nur77主要定位于胞浆并且与线粒体存在共定位。2.Westernblot显示：40μM的CC1007干预24h后,细胞核内Nur77表达升高,细胞浆内Nur77表达量不变；干预30h后,细胞核内Nur77表达下降,细胞浆内Nur77表达升高。3.40μM的CC1007干预Nur77干扰组和对照干扰组细胞30h后,MTT显示存活率为分别为(77.4±2.7)%和(63.4±0.8)%(P<0.05),Hoechst染色计数显示凋亡率分别为(43.1±1.8)%和(52.13±0.5)%(P<0.05),流式细胞仪检测显示sub-G1期细胞比例分别为(24.04±2.8)%和(30.4±2.0)%(P<0.05)。结论：1.CC1007诱导HepG2凋亡过程中首先细胞核内Nur77蛋白表达量升高,随后Nur77出细胞核至细胞浆和线粒体。2.下调Nur77能够降低HepG2细胞对CC1007的敏感性。3.CC1007诱导的Nur77起促凋亡作用。
【作者】王向阳；
【导师】霍继荣；陶光实；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】CC1007；MEF2；Nur77；细胞周期；凋亡；

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