miRNA-720对TNF-α诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡的作用及机制

【摘要】研究目的1建立原代人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外培养的方法,讨论TNF-α对该细胞凋亡程度的影响；2根据发表的论文中相同筛选方式的结果,探讨miRNA-720在HUVEC凋亡中的调节功能；3研究miRNA-720对细胞凋亡影响的机制。研究方法本实验分为三部分：1原代细胞的培养方法参考相关文献报道并加以改进,通过观察细胞形态和利用免疫细胞化学法对细胞进行鉴定；用四种方法(电镜观察,Hoechst33258荧光染色,TUNEL法以及westernblot)检测HUVEC的凋亡程度；2参考文献中有关芯片检测结果,选定miRNA-720为有意义的共同差异表达microRNA。采用miRNA-720前体(pre-miR-720)瞬时转染HUVEC从而使得内皮细胞抑制或者过表达该microRNA,设立空白对照组,用实时荧光定量PCR法检测转染的效率。然后用TNF-α干预转染后的HUVEC,再次通过Hoechst33258荧光染色、TUNEL法、实时定量PCR法以及westernblot等方法检测不同转染组与对照组的内皮细胞凋亡程度改变；3使用生物信息学软件分析,结合文献查询,预测与凋亡相关的miR-720的靶基因；用荧光素酶报告基因法验证DNMT3A是否为miR-720作用的靶基因；用miRNA-720抑制剂转染HUVEC,采用实时荧光定量PCR法和westernblot观察其是否引起靶基因表达增多；用DNAMethylationPCR检测细胞内基因甲基化的变化。研究结果(1)经相差显微镜观察以及Ⅷ因子染色证明培养的细胞中98%为HUVEC,台盼蓝染色显示95%以上细胞的存活状态良好,TNF-a能引起HUVEC凋亡;(2)Hoechst33258荧光染色,TUNEL染色,实时荧光定量PCR及westernblot结果显示：miRNA-720抑制剂使得TNF-a诱导的HUVEC凋亡数量明显减少,而miRNA-720的过表达使得TNF-a诱导的HUVEC凋亡数明显增加；(3)经过生物信息学软件的分析预测,DNMT3A很有可能是miRNA-720的候选靶基因,经过荧光素酶报告基因法,实时定量PCR,Westernblot和MSP证实miRNA-720抑制组该基因的表达有显著提升。研究结论(1)本研究以成功建立HUVEC体外培养方法为基础,建立了TNF-a诱导HUVEC凋亡的实验模型；(2)miRNA-720在TNF-a诱导的HUVEC细胞凋亡中表达明显上升,能明显促进细胞凋亡,破坏细胞生存。(3)miRNA-720促进由TNF-a介导的HUVEC凋亡的作用机理有可能是通过转录后水平抑制DNMT3A的表达来完成。
【作者】李辉；
【导师】徐军美；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】microRNA；内皮细胞；凋亡；TNF-α；甲基化；

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