大豆对低氮胁迫的形态和生理学响应及介导低氮胁迫miRNA的鉴定

【摘要】大豆(Glycinemax(L.)Merr.)作为固氮作物,虽然能够通过生物固氮获得一部分氮素,但由于大豆籽粒蛋白含量高,对氮素需求量高,增施氮肥仍然是大豆增产的必要措施。不过氮肥利用效率低,增施氮肥不仅增加生产成本,而且易对环境造成危害。因此,筛选和培育耐低氮大豆品种就显得非常必要,而这有赖于大豆耐低氮胁迫的生理学和分子生物学机理的阐明。miRNA作为一类内源性的、21-24个碱基组成的非编码单链小分子RNA,在植物生长发育和环境胁迫应答等过程中中均发挥着重要的作用,且有证据表明,miRNA也参与营养胁迫响应。因而,筛选重要的低氮胁迫响应的miRNA及其靶基因就具有重要的研究意义。本研究以前期筛选出的耐低氮胁迫的大豆品种“116”和低氮胁迫敏感的大豆品种“84-70”为试验材料,通过溶液培养试验研究低氮胁迫对不同基因型大豆根系形态和氮代谢相关指标的影响,同时也分析不同基因型大豆的叶片光合作用特性、碳水化合物积累对低氮胁迫响应的差异,从而探讨耐性品种对低氮胁迫的形态和生理耐性机制；接着利用Solexa深度测序与生物信息学手段,筛选和鉴定与低氮胁迫响应相关的miRNA,旨在揭示大豆苗期耐低氮胁迫的分子机制。研究工作获得了以下主要结果：1.根系是作物吸收氮素的主要器官,在低氮胁迫下,两个大豆品种的根长、表面积和体积均明显降低,但耐低氮品种的大豆品种“116”的降幅要少于低氮胁迫敏感的大豆品种“84-70”,另外无论是低氮胁迫还是正常供氮水平,大豆品种“116”的根长、表面积和体积均大于大豆品种“84-70”；根的平均直径在低氮胁迫下的反应与比根长、表面积和体积的反应相反,它们在低氮胁迫下有所增大,并且大豆品种“116”增加幅度要稍大于大豆品种“84-70”。2.就氮的吸收效率而言,两个大豆品种在低氮胁迫下存在差异,表现在大豆品种“84-70”在低氮胁迫下叶和根中的总氮含量和硝态氮含量与正常氮处理下相比降幅较大,而大豆品种“116”则降幅较少；而且大豆品种“116”还表现更强的氮素同化能力,因为它的氨基酸和可溶性蛋白含量在低氮胁迫下降低的幅度比大豆品种“84-70”少,这与NR活性反应一致,NR活性在大豆品种“116”根和叶中下降的幅度分别为1.7%-12.5%和1.5%-14.4%,而在大豆品种“84-70”根和叶中下降的幅度分别为3.2%-20.2%和3.8%-30.7%。另外,低氮胁迫下GS活性在两个品种中下降的幅度接近,不能解释两个大豆品种在低氮胁迫下氮素同化能力的差异。3.与大豆品种“84-70”相比,大豆品种“116”光合作用受到低氮胁迫的影响要少的多。在整个低氮胁迫处理时期,大豆品种“84-70”光合速率下降幅度为2.4%-31.5%,而在大豆品种“116”光合速率下降幅度为0.9%-14.6%。而就影响光合作用的非气孔因素和气孔因素而言,在低氮胁迫下,耐性品种的叶绿素a、b及a+b总含量与正常氮处理相比下降幅度较少,叶绿素a/b的比值较对照提高明显,而不耐品种的叶绿素a及a+b总量较对照降低幅度明显增大,叶绿素a/b的比值较对照提高比例较少；两个大豆品种的气孔导度和叶片胞间CO2也受低氮胁迫影响,与叶绿素含量受影响类似,不耐低氮大豆品种“84-70”下降的幅度比耐低氮品种“116”大。另外,低氮胁迫下大豆品种“116”的蒸腾速率和水分利用效率相对正常氮处理变化幅度分别为0.03～0.47mmo1H2O2.m-2s-1和0.01～0.28μmolCO2/mmolH2O,而大豆品种“84-70”蒸腾速率和水分利用效率变化幅度0.05～0.92mmolH2O.m-2s-1和0.04～0.63μmolCO2/mmolH2O。4.氮代谢与碳代谢密切相关,低氮胁迫处理能增加两个大豆品种的叶和根的可溶性糖含量,但增加的幅度有所差别,在叶中,大豆品种“116”的可溶性糖含量增加的幅度少于大豆品种“84-70”,但是在根中,耐低氮品种“116”的可溶性糖含量增加的幅度大于不耐低氮品种“84-70”,表明大豆品种“116”可将更多的可溶性糖转运到植株的根部来满足根系的正常生长,从而有利于从低氮环境中吸收更多的氮元素；低氮胁迫处理也能影响两个大豆品种的叶和根的淀粉含量,大豆品种“84-70”的淀粉含量在低氮胁迫下增加的幅度为0.20mg/g～3.32mg/g,而大豆品种“116”中增加的幅度为0.12mg/g～0.94mg/g,显然,大豆品种“84-70”的淀粉含量增加的幅度高于大豆品种“116”。5.利用Solexa/Illumina高通量测序,在构建的16个小RNA文库中获得了348,651,354条Totalcleanreads和52,351,387条uniquereads,经生物信息学分析,鉴定了362条已知大豆miRNAs或miRNAs变体,分属158个miRNA家族,同时还获得了归属于55个miRNA家族的90条新大豆miRNAs。需指出的是,虽绝大部分新大豆miRNAs位于基因组上的编码基因间隔区,但也有小部分新miRNA位点位于蛋白编码基因的内含子或外显子区域。6.通过分析]miRNA在低氮胁迫处理文库与其相应对照氮浓度处理文库中的差异表达,共鉴定了150个已知的miRNAs和2个新miRNAs参与大豆对短期和长期低氮胁迫的响应,其中在大豆品种“116”根和叶中,分别有14条和54条miRNA参与短期低氮胁迫的响应,分别有37条(含1条新miRNA)和28条miRNA参与长期低氮胁迫的响应；而在大豆品种”84-70″的根和叶中,分别有13条和57条miRNA(含1条新miRNA)参与短期低氮胁迫的响应,分别有34条和33条miRNA参与长期低氮胁迫的响应。这些miRNA有的可同时参与两个品种或两个时间段处理的低氮胁迫响应,并把这些低氮胁迫响应miRNA归为四类。7.差异表达miRNA的靶基因预测结果表明,在两个大豆品种的根中,68个低氮胁迫响应的已知miRNA中的53个和1个新miRNA能够预测到靶基因,靶基因总数分别为223个和14个,其余的miRNA未能预测到相关的靶基因；而在两个大豆品系的叶中,124个低氮胁迫响应的已知miRNA中的93个能够预测到靶基因,靶基因总数为399个,其余的31个的已知miRNA和1个新miRNA未能预测到相关的靶基因。这些靶基因功能主要涉及物质代谢、激素信号转导、质子传递及物质转运途径以及转录因子等。
【作者】王业建；
【导师】袁隆平；周新安；
【作者基本信息】中南大学，生物学，2013，博士
【关键词】大豆；低氮胁迫；Solexa/Illumina测序；miRNA；

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