p62/SQSTM1与自噬在结肠癌发生中的作用机制研究

【摘要】研究目的：近年来,自噬在肿瘤中发生中的作用越来越受到关注。结肠癌是消化道最常见的恶性肿瘤之一,其发病机制已有较多的研究,但机制仍不十分明了。p62蛋白是一个参与自噬、凋亡和肿瘤发生的关键蛋白,深入研究p62蛋白以及自噬与结肠癌的关系,对阐明结肠癌发病机制,寻找新的治疗策略具有积极的意义。研究方法：收集119例散发的结肠癌患者临床资料,包括性别、年龄、肿瘤原发部位、肿瘤大小、病理类型及分化程度、临床病理分期等,并收集新鲜手术标本。通过免疫组化、实时定量PCR和免疫印迹方法检测p62蛋白在肿瘤组织和癌旁正常对照组织中的表达,同时用免疫荧光和免疫印迹方法检测自噬标记蛋白LC3的表达,结合患者的临床资料进行统计学分析。同时根据人P62基因的mRNA序列构建shRNA病毒干扰质粒,利用293T细胞包装产生病毒颗粒。感染HCT-116结肠癌细胞系,通过实时定量PCR和免疫印迹技术检测病毒干扰的效果。将p62干扰成功的HCT-116细胞系进行细胞增殖、细胞生长、细胞迁移能力的检测。同时,将干扰成功的HCT-116细胞系,进行裸鼠成瘤实验,观察干扰p62蛋白的HCT-116细胞在裸鼠体内成瘤能力的改变。体外细胞干扰p62蛋白表达后,观察其对细胞自噬的影响,以及对自噬激抑制剂(3-MA)抑制结肠癌细胞增殖作用的影响。研究结果：我们的结果发现,p62蛋白和mRNA在癌旁正常组织和结肠癌组织中均有表达。通过对119例结肠癌患者的临床资料显示,结肠癌组织p62mRNA表达水平和蛋白表达量显著高于癌旁正常对照组。同时,LC3蛋白在结肠癌组织中点状聚集程度显著高于癌旁正常对照组。同时westernblot结果也显示,LC3-II的表达量在结肠癌组织中显著高于癌旁正常组织。这些结果显示,结肠癌组织中的自噬水平高于癌旁正常组织。结肠癌组织中p62和LC3-II的表达水平与患者年龄、性别、肿瘤部位、肿瘤大小、组织学类型分化程度、临床病理分期无显著相关性,提示p62和自噬可能只是在结肠癌的发生阶段发挥一定的作用。为了深入探讨p62和自噬在肿瘤发展过程中可能的作用,我们通过shRNA病毒干扰质粒,在体外包装、纯化后,成功获得高滴度慢病毒载体颗粒；通过慢病毒感染结肠癌细胞HCT-116细胞系,能显著地抑制p62mRNA水平及p62蛋白的表达。干扰p62后,HCT116细胞的细胞生长、增殖以及克隆形成明显受抑制,体内裸鼠成瘤实验也证实,HCT-116细胞的成瘤能力减弱。我们也发现,干扰p62后,HCT-116细胞的自噬受到了抑制,LC3-II表达水平降低,细胞内点状聚集减少,同时自噬抑制剂3-MA对HCT-116的抑制生长效果明显增强。结论：1.异常聚集的p62激活自噬参与结肠癌的发生。2.干扰P62和自噬抑制剂可能对结肠癌具有治疗作用,且二者具有协同作用。
【作者】任峰；
【导师】周建平；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】p62；结肠癌；自噬；LC3；shRNA；慢病毒载体；

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