核仁素对microRNAs的调控及其在心肌保护中的作用

【摘要】目的：筛选核仁素调控的miRNAs,在心肌损伤模型中观察核仁素及其调控的miRNAs在心肌保护中的作用,探讨核仁素是否通过调控miRNA的生成在损伤心肌中发挥保护作用,初探核仁素调控miRNAs的可能机制。方法：通过核仁素转基因小鼠,采用高通量技术筛选出受核仁素调控的miRNAs,并通过qRT-PCR(实时定量-逆转录-多聚酶链反应)进行验证。构建小鼠阿霉素心肌损伤与心肌缺血-再灌注损伤模型,通过Western-blot及qRT-PCR检测核仁素及其调控的miRNA在这两种模型中的表达情况。采用核仁素过表达或表达抑制以及“获得或失去功能实验”(gain-andlossof-functionexperiment)观察核仁素及其调控的miRNAs对阿霉素、H2O2所致的心肌细胞损伤的影响,观察核仁素是否通过调控miRNAs生成在损伤心肌细胞中发挥保护作用。通过生物信息学软件预测重要miRNAs的靶mRNAs,并观察其在阿霉素处理的心肌细胞中的表达情况,旨在寻找miRNAs可能的作用靶点。通过RNA免疫共沉淀技术(RNA-IP)和蛋白质免疫共沉淀技术(IP)筛选心肌组织中与核仁素发生相互作用的miRNAs及相互作用蛋白,在细胞水平通过激光共聚焦显微镜观察核仁素与其相互作用蛋白共定位情况,旨在揭示核仁素调控miRNA生成的机制。结果：(1)通过核仁素转基因小鼠,采用高通量筛选技术发现核仁素影响多种miRNAs的生成,其中miR-21等16种miRNAs表达上调,miR-1等8种miRNAs表达下调。通过qRT-PCR验证部分miRNAs,其中miR-21、miR-320在核仁素转基因小鼠中表达上调,miR-133,miR-378表达下调。(2)成功构建急、慢性阿霉素心肌损伤小鼠模型。在阿霉素损伤心肌组织以及阿霉素刺激的大鼠原代心肌细胞中miR-21和核仁素表达均上调。阿霉素刺激引起原代大鼠心肌细胞活性降低、LDH释放及细胞凋亡增加。通过核仁素真核表达载体转染大鼠心肌细胞(H9c2)发现,核仁素过表达能明显增加细胞活性、抑制DOX所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生,核仁素表达抑制进一步增高DOX所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生。同样,miR-21mimic也能明显增加细胞活性、抑制DOX所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生,miR-21inhibitor则进一步增高DOX所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生。然而,转染miR-21inhibitor能中和核仁素过表达所发挥的保护作用,而转染miR-21mimic能明显补偿核仁素表达抑制引起的细胞损伤。通过miRNAs靶基因软件分析BTG2可能是miR-21的靶mRNA,通过Western-blot检测发现,BTG2在DOX所致损伤心肌细胞中表达下调。(3)成功构建小鼠心肌缺血-再灌注损伤模型。在缺血-再灌注损伤心肌组织以及H2O2刺激的大鼠原代心肌细胞中miR-21表达均上调。在缺血-再灌注后短时间内心肌组织核仁素表达下调,但是磷酸化的核仁素表达上调。H2O2刺激引起原代大鼠心肌细胞活性降低、LDH释放及细胞凋亡增加。通过核仁素真核表达载体转染大鼠心肌细胞(H9c2)发现,核仁素过表达能明显增加细胞活性、降低H2O2所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生,核仁素表达抑制进一步增高H2O2所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生。miR-21mimic能明显增加细胞活性、降低H2O2所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生,miR-21inhibitor进一步增高H2O2所致的心肌细胞LDH释放及细胞凋亡发生。然而转染miR-21inhibitor可以中和核仁素过表达发挥的保护作用。相反,转染miR-21mimic能明显补偿核仁素表达抑制引起的细胞损伤。通过免疫共沉淀技术发现核仁素不仅能与miR-21等miRNAs结合,也能与AGO2发生相互作用。在缺血-再灌注损伤心肌组织中磷酸化的核仁素与AGO2相互作用增强。通过显微共聚焦显微镜发现磷酸化的核仁素在氧化应激时与AGO2在细胞质共定位作用增强。结论：核仁素能调控miR-21等miRNA的生成。在阿霉素心肌损伤小鼠模型以及心肌缺血-再灌注损伤小鼠模型中miR-21表达上调。核仁素通过调控miR-21的表达增加细胞活性,减少LDH释放,降低细胞凋亡率保护心肌细胞在氧化应激中的损伤。磷酸化的核仁素可能通过与AGO2相互作用而上调miR-21的生成。
【作者】童中艺；
【导师】肖献忠；蒋碧梅；
【作者基本信息】中南大学，病理学与病理生理学，2014，博士
【关键词】核仁素；microRNAs；miR-21；阿霉素；心肌缺血-再灌注损伤；心肌保护；

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