MicroRNA-296对脑缺血梗死后血管新生的调控机制研究

【摘要】背景与目的：侧枝循环的建立是改善脑梗死后脑组织血流供应的有效途径,治疗性血管生成为缺血性脑卒中血运重建提供了一种新的治疗策略。微小RNA(microRNA,miRNA)是近年发现的一类内源性非编码小分子RNA,在转录后水平调控细胞增殖分化、凋亡、分裂及器官的发育,与人类生命活动的多种疾病密切相关,已成为医学领域的研究热点。在脑肿瘤实体及体外实验中已证实miR-296通过直接抑制其靶基因HGS表达,呈现出促进血管新生的作用。本研究体内实验拟通过构建大鼠大脑中动脉闭塞(middlecerebralarteryocclusion,MCAO)脑缺血梗死模型,检测缺血梗死后脑组织中miR-296及其靶基因HGS的表达变化,同时动态观察脑缺血梗死后血管新生的变化,初步明确miR-296是否参与脑缺血梗死后血管新生过程；进一步在体外环境下培育人脐静脉内皮细胞(humanumbilicalveinendothelialcell,HUVEC),利用重组腺病毒技术过表达miR-296于HUVEC内,观察血管内皮细胞中HGS及VEGF-Notch通路相关分子VEGF、VEGFR2、DLL4和Notchl的mRNA及蛋白表达水平的变化,明确miR-296对VEGF-Notch信号通路的调控作用,深入探讨阐明miR-296参与调控脑缺血梗死后血管新生的分子机制,为缺血性脑卒中治疗提供新的靶点。研究内容与方法：1.体内实验1.1构建大鼠MCAO模型,行TTC染色以鉴定脑缺血梗死区域。于缺血梗死后第1天,第3天,第7天留取脑组织标本行相关检测。1.2采用qRT-PCR方法检测脑缺血梗死后不同时间点大鼠缺血脑皮质区miR-296的表达水平,明确脑缺血梗死后miR-296动态表达变化。1.3采用Westernblot法检测脑缺血梗死后不同时间点大鼠缺血脑皮质区HGS的蛋白表达,明确脑缺血梗死后miR-296的靶基因HGS的蛋白表达变化。1.4采用免疫组化染色法检测脑缺血梗死后不同时间点缺血脑皮质区CD105标记的新生微血管以判断血管新生的情况。2.体外实验2.1采用贴壁法培养人脐静脉内皮细胞HUVEC-12。构建腺病毒载体,将包装AdV-miR-296-GFP及AdV-GFP的重组腺病毒分别转染至HUVEC-12;荧光显微镜下观察GFP绿色荧光的阳性率。实验分为miR-296过表达组(AdV-miR-296-GFP)和对照组(AdV-GFP)。2.2行内皮细胞小管形成实验,比较miR-296过表达组与对照组内皮细胞血管形成数,明确miR-296对血管内皮细胞血管形成能力的影响。2.3采用qRT-PCR法比较miR-296过表达组与对照组中miR-296的表达水平,以明确AdV-miR-296-GFP上调miR-296表达的水平。2.4采用RT-PCR、WesternBlot法分别比较miR-296过表达组与对照组中HGS及VEGF-Notch信号通路相关分子VEGF、VEGFR2、DLL4、Notch1的mRNA和蛋白表达水平,明确miR-296对VEGF-Notch信号通路的调控途径。结果：1.体内实验1.1成功构建大鼠MCAO模型。TTC染色可见左侧大脑中动脉供血区的梗死灶呈白色,正常脑组织呈红色。1.2qRT-PCR结果显示,假手术组脑组织中可见miR-296的表达,脑缺血梗死后各时间点实验组大鼠缺血脑皮质区miR-296表达均高于假手术组(各P<0.05),miR-296在脑缺血梗死后第1天表达即开始上调(2.25±0.36),第三天表达量继续上调(5.35±0.35),7天时最明显(7.91±0.21),表明正常非缺血梗死脑组织中存在miR-296的表达,且脑缺血损伤可刺激miR-296表达水平的逐渐上调。1.3Westernblot结果显示检测脑缺血梗死后Id,3d,7d实验组大鼠缺血脑皮质区HGS的蛋白表达逐渐下降,验证了脑缺血梗死后过表达的miR-296可抑制其靶基因HGS的蛋白表达。1.4免疫组化染色结果显示,脑缺血梗死后第一天即出现CD105阳性细胞(1.8±0.84),第3天时阳性细胞数增多(6.8±2.17),第7天可见更多的新生血管(10±2.17),与miR-296表达水平呈正相关(r=0.95,P<0.05),提示miR-296促进脑缺血梗死后血管新生过程。2.体外实验2.1成功构建腺病毒载体,将包装AdV-miR-296-GFP及AdV-GFP的重组腺病毒转染至HUVEC-12细胞,荧光显微镜下可见绝大部分细胞均表达GFP绿色荧光,GFP阳性细胞率达90%以上。2.2qRTHPCR结果显示,与对照组比较,miR-296过表达组miR-296上调了320±30倍。2.3内皮细胞小管形成实验结果显示,与对照组比较,miR-296过表达组HUVEC-12细胞形成血管管腔数明显增多(28±1.5vs.8±2.5,P<0.05),表明miR-296可促进血管内皮细胞形成管腔样结构。2.4RT-PCR、westernblot结果显示,与对照组比较,miR-296过表达组HUVEC-12细胞中HGSmRNA的表达水平下降,其蛋白水平则显著下降。与此同时,VEGF、VEGFR2的mRNA和蛋白表达水平均显著上调而DLL4、Notchl的mRNA和蛋白表达水平均显著下降(各P<0.05)。结论：1.大鼠正常(非梗死)脑组织中存在miR-296的表达。2.miR-296促进大鼠脑缺血梗死后血管新生的过程。3.miR-296通过抑制其靶基因HGS的表达,上调VEGF-VEGFR2信号通路的活性,促进血管新生的过程。4.促血管生成因子miR-296抑制DLL4-Notchl信号通路的活性,其机制有待进一步研究。图16幅,表2个,参考文献116篇。
【作者】冯洁；
【导师】刘运海；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】miR-296；血管新生；脑缺血；VEGF；Notch；

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