EGFL7诱导EMT促进胃癌细胞侵袭和转移机制的研究

【摘要】背景：胃癌是人类常见的恶性肿瘤之一,最新数据显示其发病率及死亡率高居恶性肿瘤前列,导致了重大的公共健康负担。虽然对胃癌的治疗取得了显著的进步,使患者的总体生存期得以提高,但是复发和转移使胃癌患者的五年生存率仍然很低。而且大多数新诊断的胃癌患者已表现为转移性疾病,这使得对胃癌的治疗仍然是肿瘤学中的重要难题之一。近年来发现：表皮生长因子样结构域7(Epidermalgrowthfactor-likedomain-containingprotein7,EGFL7)可明显增强细胞运动迁移能力,是重要的运动刺激因子和肿瘤转移相关因子。早期研究表明,EGFL7是一种内皮细胞源性的调节血管形成的分泌因子。最近的研究报道显示,EGFL7在多种肿瘤组织和肿瘤细胞系中表达,包括肾癌,恶性神经胶质瘤,肝癌和结肠癌。我们前期预实验结果显示,在胃癌组织中也有EGFL7的表达,而且其表达与病理组织分化程度、临床进展、预后和转移显著相关。因此,EGFL7可能作为预测癌症进展和转移的新分子标记。然而它在胃癌中的具体作用机制目前尚不清楚,有必要进行下一步深入研究。肿瘤转移是一个多步骤的过程,其中极化上皮细胞被转化为间充质细胞触发上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymaltransition,EMT)是转移过程中间重要的环节。EMT赋予细胞间充质表型从而增加细胞的侵袭和迁移能力,启动转移级联反应。已有研究表明,表皮生长因子(EGF)诱导EMT的活化促进了肿瘤细胞的侵袭和迁移。与EGF有相似之处,EGFL7包含2个EGF样结构域。然而,EGFL7是否通过这两个结构域或者其中一个结构域来调控EMT,促进癌细胞转移仍有待确定。此外,EGFL7在胃癌(gastriccancer,GC)中通过EMT调节的分子机制仍是未知的,目前未见相关文献报道。目的：1、研究沉默EGFL7基因对胃癌细胞BGC823的侵袭和转移等生物学行为的影响。2、研究EGFL7过表达及缺失相关结构域对胃癌细胞MKN28侵袭和转移等生物学行为的影响。3、探究EGFL7诱导EMT促进胃癌细胞侵袭和转移的机制。方法1、研究沉默EGFL7基因对胃癌细胞BGC823侵袭和转移等生物学行为的影响(1)运用Western-blotting和Real-TimePCR检测EGFL7在胃癌细胞株(BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45)和胃黏膜正常细胞株GES-1中的表达,筛选出EGFL7高表达胃癌细胞株。(2)构建EGFL7干扰质粒载体(pGPU6/GFP/Neo-EGFL7-shRNA)及阴性对照质粒载体(pGPU6/GFP/Neo-nonspecific-shRNA);建立EGFL7基因沉默的稳定转染细胞系。(3)通过侵袭实验、迁移实验和划痕实验比较各实验细胞系的侵袭性和转移性。(4)运用MTT实验和细胞平板克隆形成实验观察肿瘤细胞增殖和生长的情况。(5)使用流式细胞术检测肿瘤细胞失巢凋亡的情况。(6)裸鼠成瘤实验：观察裸鼠体内移植瘤的生长情况；解剖裸鼠并切取移植瘤,观察肿瘤细胞向远处转移的情况,制作HE切片观察肿瘤的病理形态特征。2、研究EGFL7过表达及缺失相关结构域对胃癌细胞MKN28侵袭和转移等生物学行为的影响(1)Western-blotting和Real-TimePCR检测EGFL7在胃癌细胞株(BGC823、SGC7901、MKN28和MKN45)和胃黏膜正常细胞株GES-1中的表达,筛选出EGFL7低表达胃癌细胞株。(2)构建针对EGFL7过表达的突变质粒载体,然后在这突变的载体基础上进行缺失结构域质粒载体的构建,分别缺失EMI(简称：AEMl)、EGF(简称：⊿EGF)、EGF-ca结构域(简称：⊿EGF-ca),得到pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-EGFL7+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿EMI+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿EGF+Flag、pGCMV/MCS/IRES/EGFP/Neo-⊿EGF-Ca+Flag质粒载体；分别转染至EGFL7低表达胃癌细胞株中,经G418筛选获得稳定转染细胞系。(3)通过侵袭实验、迁移实验和划痕实验比较各细胞系的侵袭性和转移性。(4)运用MTT实验和细胞平板克隆形成实验观察肿瘤细胞增殖和生长的情况。(5)使用流式细胞术检测肿瘤细胞失巢凋亡的情况。(6)裸鼠成瘤实验：观察裸鼠体内移植瘤的生长情况；解剖裸鼠并切取移植瘤,观察肿瘤细胞向远处转移的情况,制作HE切片观察肿瘤的病理形态特征。3、探究EGFL7诱导EMT促进胃癌细胞侵袭和转移的机制(1)观察EGFL7基因沉默及EGFL7过表达后胃癌细胞的形态变化。(2)收集临床胃癌及癌旁组织标本79例,采用免疫组织化学方法检测并分析EGFL7与EMT相关分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)之间的相关性。(3)运用Real-TimePCR检测EGFL7基因沉默和EGFL7过表达及其缺失结构域的细胞系中的EMT相关分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵袭转移指标(MMP-9)和血管新生指标(VEGF)的mRNA表达水平。(4)使用Western-blotting检测EGFL7基因沉默、EGFL7过表达及其缺失结构域的细胞系中的EMT相关分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵袭转移指标(MMP-9)和血管新生指标(VEGF)的蛋白表达水平以及EGFR、ERK和AKT的总表达及磷酸化水平。(5)先用EGF受体(EGFR)抑制剂AG1478处理EGFL7高表达细胞株(BGC823和MKN28-EGFL7),再用Western-blotting检测EMT相关分子(E-Cadherin、Vimentin和Snail)、侵袭转移指标(MMP-9)和血管新生指标(VEGF)的蛋白表达水平以及EGFR、ERK和AKT的总表达及磷酸化水平；通过迁移实验和划痕实验比较抑制剂处理前后的细胞运动情况的变化。结果：1、沉默EGFL7基因能够降低胃癌细胞的侵袭和转移能力(1)EGFL7在胃癌细胞BGC823中表达量最高；EGFL7基因沉默的稳定胃癌细胞系建立成功。(2)EGFL7基因沉默能够诱导胃癌细胞失巢凋亡,抑制胃癌细胞的侵袭和转移,但不能影响胃癌细胞的增殖和生长。(3)与对照组比较,EGFL7基因沉默组的裸鼠体内肿瘤肝转移数目减少。2、EGFL7过表达能够增强胃癌细胞的侵袭和转移能力,EGF结构域是EGFL7的效应结构域(1)EGFL7在胃癌细胞MKN28中表达量最低；EGFL7过表达及缺失结构域的稳定胃癌细胞系建立成功。(2)EGFL7过表达能够提高胃癌细胞的失巢凋亡抵抗能力,抑制凋亡,促进胃癌细胞的侵袭和转移,但不能影响胃癌细胞的增殖和生长。(3)在缺失EGF结构域后能升高胃癌的失巢凋亡,抑制胃癌细胞的侵袭和转移,说明EGF结构域是EGFL7的效应结构域。(4)与对照组比较,EGFL7过表达组的裸鼠体内肿瘤肝转移数目增加。3、EGFL7通过AKT的磷酸化促进胃癌细胞的EMT(1)EGFL7表达高的细胞株细胞形态显示为细胞间紧密连接减少和典型的梭形间质细胞形态,而EGFL7表达低的细胞株的细胞形态呈小细胞大小和鹅卵石样的形状,细胞间紧密排列呈现典型的上皮细胞样形态。(2)采用Spearman相关性检验进行相关分析。EGFL7表达与Vimentin的表达成正相关(r=0.620,P<0.05),与Snail的表达亦成正相关(r=0.492,P<0.05)。但是,它的表达与E-Cadherin的表达呈负相关(r=-0.304,P<0.05)。(3)EGFL7基因沉默能够降低EGFR和AKT磷酸化水平。(4)EGFL7基因沉默能够抑制Vimentin、Snail、MMP-9和VEGF的表达,而促进E-Cadherin的表达。(5)EGFR的抑制剂能够降低EGFR和AKT的磷酸化水平。(6)EGFR抑制剂能够抑制Vimentin、Snai1、MMP-9和VEGF的表达,而促进E-Cadherin的表达。结论：1、沉默EGFL7基因的胃癌细胞的失巢凋亡抵抗能力减弱,侵袭和转移能力降低,但不能影响胃癌细胞的增殖和生长。2、EGFL7基因通过其EGF结构域来促进胃癌细胞的侵袭和转移。3、我们首次证明了胃癌转移的重要调节因子EGFL7,通过EGFR-AKT-Snail信号通路来激活EMT进而促进胃癌细胞的转移,阻断EGFL7-EGFR-AKT-Snail通路可能成为胃癌治疗的新策略。图37幅；表7个；参考文献142篇。
【作者】罗柏花；
【导师】文继舫；王宽松；
【作者基本信息】中南大学，基础医学，2014，博士
【关键词】表皮生长因子样结构域-7；上皮-间质转化；胃癌；结构域；上皮生长因子受体；磷酸肌醇-3激酶/蛋白激酶B；侵袭和转移；

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