miR-217靶向调控E2F3在肝细胞癌侵袭转移中的作用研究

【摘要】[研究背景与目的]肝癌是世界范围内最常见且恶性程度很高的肿瘤之一,严重危害人类健康,尤其在我国肝癌死亡率位居各种肿瘤死亡率的第2位,且死亡率仍呈上升趋势。尽管近年来针对肝癌的治疗方法取得了长足的进展,但肝癌的总体治疗效果仍相当不理想,其中肝癌的侵袭转移和复发是影响肝癌综合治疗效果提高的关键因素。因此,阐明肝癌发生侵袭转移的分子机制,明确肝癌发生侵袭转移的始动因素,筛选鉴定肝癌侵袭转移新靶点,从分子层面对肝癌侵袭转移进行诊断或干预有重要的理论和现实意义。近年来,miRNAs作为表观遗传学方式转录后调节器基因的表达式在肿瘤中的功能作用倍受关注,基础研究与临床观察发现miRNAs可能参与包括肝癌在内的几乎所有肿瘤的发生发展、治疗转归及预后等各个环节。其中miRNAs可能通过影响肿瘤细胞的运动能力、肿瘤血管生成及肿瘤微环境等参与肿瘤的侵袭转移,尽管miRNAs在肝癌中的作用已有所报道,但miRNAs在其侵袭转移中的作用及其机制仍未完全明了。故本课题将从细胞和临床组织标本中分析潜在抑癌基因miR-217与肝癌侵袭转移的相关性,并通过生物信息学分析结合实验验证探讨miR-217参与肝癌侵袭转移的可能分子机制,为进一步探讨肝癌侵袭转移的分子信号调控网络、开展以miR-217为靶点研究针对肝癌侵袭转移的新的治疗策略提供重要的理论依据。[方法]1.体外培养具有不同侵袭能力的肝癌细胞Huh7、HepG2、SMMC7721、MHCC-97L和MHCC-97H,用Transwell实验验证各细胞系的侵袭能力,用miRNAs抽提试剂盒抽提各细胞的miRNAs和mRNA,经miRNAs特异性逆转录试剂盒逆转录后,以U6为内参,用实时定量PCR检测各细胞中miR-217的表达情况；2.将细胞培养至50%-70%融合度时,用脂质体法将miR-217mimics或相应对照导入MHCC-97H细胞以过表达miR-217,用Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力的变化；3.将细胞培养至50%-70%融合度时,用脂质体法将miR-217特异性抑制物(inhibitor)或相应对照分别导入Huh7和MHCC-97L细胞以抑制miR-217的表达,用Transwell实验检测转染前后细胞侵袭能力的变化；4.收集临床肝细胞癌组织及正常肝组织标本,根据转移情况分为转移组和非转移组,用miRNAs抽提试剂盒抽提各肝癌组织及正常肝组织中1niRNAs,逆转录后,用实时定量PCR检测各组织中miR-217的表达情况；5.通过在线生物信息学数据库分析miR-217的可能靶基因,并选择在物种间具有保守性的miR-217靶向调控的基因E2F3用于后续研究；6.将抽提的各肝癌细胞mRNA逆转录后,用实时定量PCR检测mRNA水平E2F3的表达,抽提各细胞系及有／无miR-217表达干预细胞系的蛋白后,用Westernblot检测E2F3在蛋白水平的表达；7.合成含有SpeI和HindIII酶切位点及miR-217结合位点的E2F3mRNA3’UTR的DNA片断(野生型)或缺失miR-217结合位点的DNA片段(突变型),分别克隆入miRNA报告基因载体pMir-Report,分别获得野生型和突变型报告基因载体,将野生型或突变型报告基因载体与pRL-TKRenilla载体(海肾荧光素酶报告基因,作为内对照)共转染相应的肝癌细胞行双荧光素酶报告基因实验；或将野生型或突变型报告基因载体、pRL-TKRenilla载体与miR-217mimics或对照共转染293T细胞,行双荧光素酶报告基因实验；8.设计三条靶向E2F3基因的特异性siRNAs和对照,用脂质体将siRNA导入MHCC-97H细胞,抽提蛋白,westernblot检测E2F3的干扰效果,选择干扰效果较好的siRNA片段用于后续实验,用Transwell实验检测E2F3干扰前后细胞侵袭能力的变化；9.免疫组化方法检测转移组和非转移组肝癌组织及正常肝脏组织中E2F3的表达情况。[结果]1.各肝癌细胞中,MHCC-97H细胞的侵袭能力明显高于Huh7、HepG2、SMMC7721和MHCC-97L细胞,miR-217在高侵袭能力MHCC-97H肝癌细胞中的表达明显低于低侵袭能力肝癌细胞中的表达(p<0.05)；2.miR-217过表达明显抑制MHCC-97H细胞的侵袭能力,发生侵袭的细胞数由52±4.54个/视野降为8±1.28个/视野(p<0.05)；3.抑制miR-217的表达可明显增加Huh7和MHCC-97L细胞的侵袭能力,发生侵袭细胞数分别从2±0.20个/视野和3±0.25个/视野增加为32±2.52个/视野和37±2.85个/视野(p<0.05)；4.相比于正常肝组织,转移组有90.48%肝癌组织中miR-217的表达下调超过2倍,非转移组中仅有14.81%肝癌组织中miR-217的表达下调超过2倍,两者比较差异具有统计学意义(p<0.05)；5.生物信息学预测E2F3可能是miR-217调控的靶基因,E2F3在高侵袭能力肝癌细胞中的表达明显高于低侵袭能力肝癌细胞中的表达,miR-217过表达可下调MHCC-97H细胞中E2F3的表达,而抑制miR-217的表达则上调Huh7和MHCC-97L细胞中E2F3的表达；6.报告基因实验发现各检测肝癌细胞中野生型报告基因的活性明显低于突变型报告基因的活性,且野生型报告基因在MHCC-97H细胞中的活性比其在Huh7细胞和MHCC-97L细胞中的活性分别高出48.46%(P<0.05)和42.24%(P<0.05),而各肝癌细胞中突变型报告基因的活性无明显差异；在293T细胞中,相比于对照,miR-217使野生型报告基因的活性下调54.82%,而对突变型报告基因载体的活性无明显影响；7.2#siRNA片段能明显下调MHCC-97H细胞中E2F3的表达,且使细胞侵袭数目从58±5个/视野降为18±3个/视野(p<0.05),同时免疫组化结果提示相比于正常肝组织及无转移组肝癌组织,转移组肝癌组织中E2F3的表达明显上调。[结论]1.miR-217在高侵袭能力肝癌细胞和转移性肝癌组织中的表达明显下调；2.过表达miR-217明显抑制肝癌细胞的侵袭能力,而抑制miR-217则明显增加肝癌细胞的侵袭能力；3.肝癌细胞中miR-217能靶向调控E2F3的表达；4.干扰下调E2F3的表达能抑制肝癌细胞的侵袭能力；5.miR-217与肝癌的侵袭转移呈负相关,有望成为肝癌侵袭转移的早期诊断或干预靶点。图14幅,表5个,参考文献101篇
【作者】苏婧；
【导师】钟美佐；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】肝癌；侵袭；转移；miR-217；E2F3；

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