eIF3a和p27/Kip1表达变异对非小细胞肺癌化疗预后的影响及eIF3a抑制剂的筛选

【摘要】研究背景与目标：肺癌是我国及世界范围最常见的恶性肿瘤,其发病率和死亡率均居首位。化学治疗是最重要的肿瘤治疗手段,寻找肺癌化学治疗的影响因子及作用靶点,是当前极为关注的研究课题。肿瘤中异常表达的基因可能参与肿瘤发生发展过程中的关键环节,并影响其它肿瘤相关因子和通路的状态。这些基因表达状态的异常对肿瘤的化疗及预后可能具有重要的预测意义,其本身可能成为抗肿瘤治疗的潜在靶点。eIF3a是真核翻译起始因子3的最大亚基,其在多种肿瘤呈现高表达现象。已知eIF3a参与调控翻译和分化,并与细胞周期密切相关。然而对其在肺癌等肿瘤表达的机制和意义并不清楚。本课题组前期对eIF3a在肺癌的表达及分子机制进行了初步探索,发现eIF3a的高表达可增加肺癌患者对铂类化疗的敏感性,并证实eIF3a从翻译水平调控影响DNA修复的NER途径。我们由此推测eIF3a的表达可能对于肺癌的预后及化疗效果具有预测意义。同时,近来的相关研究中,发现了一些与eIF3a密切相关的重要因子和通路,如p27/Kipl和ERK通路。这些因子和通路的状态,本身也具有重要的临床预测意义。并且,多数细胞水平研究显示eIF3a的过表达促进肿瘤的恶性表型和耐药性。因此,目前对于eIF3a对肿瘤发生和预后的意义存在着不同的观点。本研究拟采用临床研究的方法,从组织学角度对eIF3a及与其相关的通路及因子进行证实研究。非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%,是肺癌的主要类型。化疗可以有效改善NSCLC患者术后生存。本研究计划在肿瘤组织水平研究与eIF3a相关的因子和信号通路的表达情况,并对NSCLC手术完全切除患者进行回顾性研究,调查eIF3a表达水平及相关因子对肺癌预后及术后化疗的预测意义。含羞草酸为一类含有α-氨基酸结构的吡啶酮类天然化合物,抑制eIF3a的表达,阻滞细胞周期。我们推测,eIF3a抑制剂可能产生特异的抗肿瘤增殖活性。并且,在研究eIF3a功能与肿瘤相关关系的时候,eIF3a抑制剂具有重要的先导化合物价值。因此本研究准备从抑制eIF3a及抗肿瘤增殖两方面,筛选一系列吡啶酮类衍生化合物生物活性。研究方法：基于以上研究背景,本课题拟采用下述研究方法以达到研究目的：(1)采用分子克隆及免疫方法制备eIF3a的原核蛋白及多克隆抗体；(2)采用免疫组织化学方法在NSCLC组织中调查eIF3a及p27/Kip1和ERK通路等相关因子和信号通路的表达水平,采用Spearman等级相关系数法评价各生物标志物表达水平的相关程度,采用卡方检验生物标志物之间及其与人口统计学资料及病理特征等临床参数之间的相关程度；(3)采用Kaplan-Meier法分析疾病相关生存期(DSS)及无病生存期(DFS),采用log-rank检验(单因素分析),建立Cox比例风险模型进行多因素分析,调查eIF3a表达水平与相关因子对肺癌术后及化疗预后的预测意义；(4)筛选具有抑制肿瘤细胞生长及调控eIF3a表达的合成吡啶酮类衍生化合物。研究结果：研究中我们获得下列结果：(1)获得了针对eIF3aC端的原核表达载体及高效价的eIF3a多克隆抗体；(2)eIF3a,p27/Kip1和ERK在NSCLC组织中的表达普遍,且存在正相关关系。特别是eIF3a和p27/Kipl在亚细胞部位(胞浆及胞核)的表达呈较强的正相关关系：Spearman等级相关系数r=0.653(胞浆),r=0.716(胞核)。而p-ERK在NSCLC组织中显著低表达,阳性表达呈局部点灶状。尚不能评价p-ERK/ERK与eIF3a在组织表达水平的相关关系。同时eIF3a在分化较好,鳞癌组织中表达较高；p27/Kipl在分化较好的NSCLC中表达较高；(3)对537例NSCLC术后患者进行探索研究,发现胞核表达的eIF3a和p27/Kip1对NSCLC术后生存有积极意义,两者均高表达为独立的预后预测指标(死亡风险比值比HR=0.360,95%CI=0.109-0.782,P=0.028)。化疗预后分析显示胞浆高表达的eIF3a对Ⅱ期NSCLC患者具有化疗预测价值。对扩大样本的Ⅱ期NSCLC患者进行验证研究显示,胞浆高表达eIF3a(P–0.036),胞核低表达p27/Kip1(P=0.031)的NSCLC患者能从术后化疗获益；(4)以吡非尼酮为先导化合物,合成其不同侧链修饰的衍生化合物。通过MTT法考察衍生化合物对高表达eIF3a的肺癌细胞A549及低表达eIF3a的肺纤维细胞NIH3T3的抑制作用,进行结构-选择性分析和构效分析,确定活性化合物,并从蛋白和核酸表达水平进行验证。研究结论：通过本研究,我们得出下列结论：(1)eIF3a与p27/Kipl在NSCLC组织中的表达状态存在显著相关；(2)eIF3a和p27/Kipl在NSCLC组织的不同表达状态及相关关系,有助于预测NSCLC完全切除患者的中期预后,并可一定程度预测术后化疗的可能获益,可能成为NSCLC预后的候选生物标志物；(3)具有“Y”型结构的1-苯基-5-苯氧甲基-2吡啶酮衍生物呈现对eIF3a和肿瘤细胞的显著抑制活性.其中间二苯胺类化合物抑制eIF3a表达作用较强。这些新化合物的活性,理化性质均优于含羞草酸,可开发为新型抗肿瘤先导化合物。创新点：自主获得eIF3a的C端重组蛋白及相应抗体；从病理组织学角度证实了eIF3a与p27/kipl的相互关系,首次探讨eIF3a作为肺癌预后和化疗预测标志物的临床意义；筛选了能够调节eIF3a表达而抑制肿瘤细胞生长的新型衍生化合物,为抗肺癌治疗提供新的研究思路。
【作者】沈杰；
【导师】刘昭前；
【作者基本信息】中南大学，临床药理学，2014，博士
【关键词】eIF3a；p27/Kip1；非小细胞肺癌(NSCLC)；化疗；吡啶酮类；

【参考文献】
[1]李杰.夏天无总生物碱微孔渗透泵片的研究[D].成都中医药大学,药剂学,2012,硕士.
[2]陈科.恶性淋巴瘤证候要素探讨及浙贝黄芩汤增效作用研究[D].北京中医药大学,中西医结合临床,2014,硕士.
[3]潘志峰.基于ADI半实物仿真系统感应电机直接转矩控制研究[D].安徽大学,检测技术与自动化装置,2014,硕士.
[4]罗星.健脾消癌方对裸鼠大肠癌肝转移模型VEGF以及VEGFR-2表达的影响[D].湖南中医药大学,中医内科学,2014,硕士.
[5]陈子龙,陆宇坤.税收滞纳金性质与制度修订研究[J].税收经济研究,2014,05:43-50.
[6]郭姣.基于车载激光的道路平整度检测系统研究[D].首都师范大学,地图学与地理信息系统,2013,硕士.
[7]张建,王锐,苏党生.纳米金刚石非金属催化性能研究进展[J].中国科学:化学,2012,04:406-414.
[8]吴建挺.芳香植物抗菌精油筛选及其杀菌成分分离鉴定[D].山东师范大学,微生物学,2013,硕士.
[9]黄剑锋.广州电信发展无线市话业务的市场战略研究[D].暨南大学,2003.
[10]李迎迎,孟郁洁,夏兰芳,陈倩倩,李月,戚晓鹏.高速公路对居民健康影响的研究进展[J].环境与健康杂志,2014,01:80-83.
[11]王琼,王文涛,刘宁.我国节能服务业存在的问题及对策建议[J].中国能源,2014,09:27-30.
[12]刘凡.基于AD+TRIZ快速夹紧机构创新设计[D].苏州大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[13]缪雄谊.黄河三角洲滨海湿地表层土壤矿物与地球化学特征研究[D].中国海洋大学,矿物学、岩石学、矿床学,2014,硕士.
[14]宋澄.防空武器系统打击能力研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2013,硕士.
[15]刘计龙,肖飞,陈伟,范学鑫,王瑞田.分布式控制同步误差对H桥并联拓扑结构均流特性影响分析[J].电力系统自动化,2015,04:123-128.
[16]徐兆阳.基于多层次控制的多分类器融合遥感影像分类[D].辽宁工程技术大学,摄影测量与遥感,2012,硕士.
[17]刘彩云.上海市柔性退休年龄政策实施效益评价分析[D].上海工程技术大学,社会保障,2013,硕士.
[18]张晓阳.面向复杂系统生命周期的故障诊断技术研究[D].南京理工大学,2005.
[19]孙逊.中学地理教学中相异概念的成因与转变研究[D].曲阜师范大学,课程与教学论,2013,硕士.
[20]刘正风.浅谈公安信息网络安全保障体系[J].网络安全技术与应用.2002(02)
[21]张亲彦.锆快中子核反应截面模型参数灵敏度与协方差评价研究[D].山西师范大学,粒子物理与原子核物理,2014,硕士.
[22]田红梅.试论图书馆从信息服务走向知识服务[J].情报理论与实践,2003,04:312-314.
[23]潘慧茹.我国农村土地承包经营权流转问题研究[D].复旦大学,马克思主义中国化研究,2012,硕士.
[24]马楠.女性主义叙事学解读—《接骨师之女》[D].河北师范大学,英语语言文学,2012,硕士.
[25]赵鑫.基于RS、GIS的哈密三道岭矿区生态环境调查与评价[D].西安科技大学,测绘工程,2013,硕士.
[26]索占伟.小檗碱抗大肠杆菌毒素致肠黏膜微血管内皮细胞损伤的初探[D].中国农业大学,临床兽医学,2004,硕士.
[27]马公拓.试谈上海新型公共汽车[J].城市公用事业.2005(04)
[28]张正亮.基于近似计算法的沥青路面局部应变分析与疲劳寿命预估[D].长安大学,道路与铁道工程,2013,硕士.
[29]梁雪君.梯度铝石墨散热器材料的制备及性能研究[D].江南大学,2014.
[30]李超娟.中小型水电工程EPC项目风险分析及对策研究[D].西安建筑科技大学,工程经济与管理,2013,硕士.
[31]王胜国.具有根轨迹渐近特性不变的广义补偿的一种综合算法[J].自动化学报,1987,04:287-292.
[32]尹艺冉.蓝藻酸解液与铁氧化物对微晶纤维素酶解过程的作用研究[D].合肥工业大学,环境工程,2014,硕士.
[33]王丹.长白山垂直样带森林土壤碳矿化及其温度敏感性研究[D].西南大学,自然地理,2014,硕士.
[34]梁遥.不同电针头穴透刺对帕金森模型大鼠脑内黑质Na~+-K~+-ATPase活性影响的实验研究[D].黑龙江省中医药科学院,针灸推拿学,2013,硕士.
[35]李骏.关于快餐门店可获店址的选择研究[D].大连海事大学,管理科学与工程,2004,硕士.
[36]方金林.宁波市船舶海难事故综合风险评估[D].宁波大学,人文地理学,2013,硕士.
[37]张婷.中欧光伏产品贸易摩擦研究[D].安徽大学,国际贸易学,2014,硕士.
[38]黄星.爆炸激震数值模拟和激震效应研究[D].西南交通大学,岩土工程,2014,硕士.
[39]段志永.市场经济条件下领导干部从政道德建设研究[D].河南科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[40]黄丽丽,肖亮,韦志辉,张军.空间移不变系统图像超分辨复原的快速解耦算法[J].自动化学报,2010,02:229-236.
[41]李轶斐.黄庭坚大字行楷书对明代吴门书家的影响[D].首都师范大学,美术,2014,硕士.
[42]舒月,张勇.基于案例推理的测试序列生成方法研究[J].铁路计算机应用,2014,06:16-20.
[43]调查人中共浙江省委常委宁波市委书记刘奇.新材料孕育产业发展新活力[N].光明日报,2014-06-10011.
[44]徐昊,马进,付红军,胡扬宇,孙素琴.负荷模型不确定性对多机系统小扰动稳定的影响分析[J].电力系统自动化,2010,21:17-20.
[45]计时鸣,钟佳奇,谭大鹏,池永为,李琛.结构化流道环境下不同颗粒浓度的磨粒群分布及其动力学特性[J].农业工程学报,2012,04:45-53.
[46]李健.供暖企业收费管理系统的设计与实现[D].东北大学,计算机技术,2011,硕士.
[47]周星龙.600MW循环流化床锅炉炉膛气固流动和受热面传热的研究[D].浙江大学,2012.
[48]常龙龙.聚乙二醇—聚己内酯疏水段修饰及作为纳米载体的性质研究[D].天津大学,材料学,2013,硕士.
[49]周兵.活性炭吸附脱硫实验研究和数学模拟[D].华东理工大学,化学工程,2014,硕士.
[50]马宏岩,王东升,冯德成,臧宏阳.沥青混合料骨料变异性对路面低温开裂的影响[J].建筑材料学报.