Chemerin调控HUVECs分泌NO的信号通路研究及其与子痫前期的关系

【摘要】子痫前期是常见的妊娠期特发性疾病。重度子痫前期,是孕产妇及围生儿发病及死亡的主要原因之一。子痫前期发病的中心环节是患者全身弥漫性内皮细胞激活/损伤。因为chemerin是一个新发现的与高血压、炎症免疫、肥胖胰岛素抵抗、代谢综合征等密切相关的脂肪细胞因子,同时子痫前期与心血管疾病及代谢性疾病有着共同的危险因素,且子痫前期孕妇产后远期心血管疾病及代谢性疾病的风险增高,这些提示chemerin可能在子痫前期病变中有重要作用。目前数据大多来源于血清chemerin在内科疾病中的研究。Chemrin与子痫前期的关系少见报道,而chemerin对内皮细胞功能的调控作用更是罕见。本博士课题对chemerin在孕妇血清胎盘中的表达及人脐静脉内皮细胞中的作用进行探讨,以期对子痫前期发病及治疗提供新的靶点。第一部分：脂肪因子chemerin在子痫前期中的表达变化及意义目的：研究脂肪因子chemerin(又称他扎罗汀诱导基因2或者视黄酸受体反应蛋白2,RARRES2)与子痫前期发病的关系。方法：选取2012年1月～2013年1月在中南大学湘雅二医院产检并分娩的孕晚期、单胎、初诊为子痫前期(PE)的孕妇。其中轻度子痫前期(MPE)孕妇30例,重度子痫前期(SPE)孕妇30例；随机选取同期单胎正常妊娠孕妇28例为正常对照组(NC)。采用ELISA检测各组孕妇血清chemerin水平,利用FQ-PCR和WesternBlot分别检测各组孕妇胎盘组织中chemerinmRNA和蛋白的表达水平,并进行统计学分析。结果：1.MPE组孕妇血清chemerin水平为(330.23±56.22)ng/ml,SPE组为(493.83±105.23)ng/ml,对照组为(220.00±50.78)ng/ml;两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。2.MPE组孕妇胎盘组织中chemerinmRNA的相对表达量为(3.04×10-4±0.87×10-4),SPE组为(4.00×10-4±1.11×10-4),对照组(1.13×10-4±0.54×10-4)；两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。3.MPE组孕妇胎盘组织中chemerin蛋白的相对表达量为(1.20±0.17),SPE组为(1.84±0.40),对照组为(0.57±0.15),两两比较,差异均有统计学意义(P<0.05)。4.孕妇血清chemerin水平与胎盘组织chemerinmRNA、蛋白的表达水平及收缩压、舒张压、BMI及血清胰岛素呈正相关,与eNOS呈负相关,相关系数r值分别为0.690(P<0.001)、0.655(P<0.001)、0.724(P<0.001)、0.627(P<0.001)、-0.727(P<0.001)。结论：1.孕妇外周血清及胎盘组织中均有chemerin的表达。2.子痫前期孕妇外周血清及胎盘组织中chemerin的表达水平与病情严重程度有关。第二部分：Chemerin对脐静脉内皮细胞(HUVECs)功能的影响目的：培养人原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)并研究chemerin对HUVECs分泌NO功能的影响。方法：获取新鲜的脐带组织,用酶消化法培养出HUVECs,用HUVECs特异性抗体第Ⅷ因子相关抗原免疫荧光染色进行鉴定。将HUVECs分组,分别给予不同浓度的chemerin(0,10,100,500,1000ng/ml)或不予chemerin干预HUVECs12、24.48小时后,收集上清培养液,用GriessReagent试剂盒测定细胞培养液中的亚硝酸盐(nitrite,N02-)的浓度,其作为NO的稳定代谢产物反映NO的浓度变化。结果：(1)镜下观察细胞生长良好,内皮细胞呈单层铺路石样外观。经过镜下观察和Ⅷ因子相关抗原鉴定证明是脐静脉内皮细胞。(2)不同浓度chemerin干预不同时间后,浓度为10～500ng/ml的chemerin诱导培养HUVECs后收集培养上清液中NO的浓度比对照组升高,具有统计学意义(P<0.05),且随chemerin浓度增加NO浓度升高(P<0.05)。而浓度500、1000ng/ml处理HUVECs不同时间后NO的产生差异无明显统计学意义(P>0.05)。结论：原代人脐静脉内皮细胞培养成功；浓度为10～1000ng/ml的chemerin上调HUVECsNO产生,且在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性。第三部分：Chemerin调控HUVECs分泌NO作用及机制研究目的：探讨chemerin在诱导脐静脉内皮细胞(HUVECs)产生一氧化氮(NO)中的作用及其机制。方法：(1)用蛋白印迹法(WestBlot)检测用0,10,100,500,1000ng/mlchemerin处理后24h,HUVECs中一氧化氮合酶(endothelialnitricoxidesynthase,eNOS)第1177位的丝氨酸(serine-1177,Ser-1177)的磷酸化状态,同时检测丝/苏氨酸激酶(serine/threoninekinase,Akt)第473位的丝氨酸(serine-473,Ser-473)的磷酸化状态变化。(2)为确定chemerin作用的信号通路,分别应用P13K抑制剂LY294002或eNOS抑制剂L-NAME与chemerin共同干预,观察能否影响chemerin对磷酸化eNOSSer-1177和AktSer-473蛋白表达。结果：(1)Chemerin组较对照组p-eNOS及p-Akt蛋白表达增高(P<0.05)；并在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性(P<0.05)。(2)Chemerin+LY294002组p-AKT、p-eNOS水平较chemerin组下降(p<0.05);chemerin+L-NAME组p-eNOS水平较chemerin组下降(P<0.05)。结论：浓度为0～1000ng/ml的chemerin通过活化P13K-AKT-eNOS信号通路上调NO产生；且在0～500ng/ml范围内呈剂量依赖性。第四部分：chemerin抑制TNF-a诱导的HUVECs的VCAM-1蛋白表达目的：探讨chemerin对TNF-a诱导脐静脉内皮细胞(HUVECs)的产生VCAM-1的作用及其机制。方法：(1)TNF-a通过NF-κB途径诱导HUVECs损伤模型：将不予药物干预的正常培养细胞作为对照组；将给予5ng/ml的TNF-a干预6小时的细胞(即]HUVECs损伤模型),作为研究1组；将给予5ng/ml的TNF-a干预6小时后+10μMNF-κB抑制剂(吡咯烷二硫代甲酸铵盐,PDTC)30分钟作为研究2组；(2)chemerin对TNF-α诱导下HUVECs表达NF-κB和VCAM-1的影响：将不予药物干预的正常培养细胞作为对照组；将给予5ng/ml的TNF-α干预6小时的细胞(即]TUVECs损伤模型)作为研究1组；将给予500ng/ml的chemerin预处理24小时后+5ng/ml的TNF-a干预6小时作为研究2组；将给予500ng/ml的chemerin+5μmol/ml的LY294002预处理24小时后+5ng/ml的TNF-α干预6小时作为研究3组；将给予500ng/ml的chemerin+0.5mmol/ml的L-NAME预处理24小时后+5ng/ml的TNF-a干预6小时作为研究4组。各组分别收集蛋白检测磷酸化NF-κBp65(Ser536)及VCAM-1蛋白表达。结果：(1)与对照组比较,TNF-a组NF-κB及VCAM-1蛋白表达水平升高(P<0.05);TNF-a+PDTC组NF-κB及VCAM-1的蛋白表达较TNF-α组降低(P<0.05),但与对照组比较仍有差异(P<0.05)。结果表明TNF-α通过NF-κB诱导HUVECs的VCAM-1的水平上调。(2)chemerin+TNF-a组VCAM-1和NF-κB的蛋白表达水平较TNF-a组下降(P<0.05);chemerin+TNF-a+LY29004组VCAM-1和]SIF-κB蛋白表达水平较chemerin+TNF-a组升高(P<0.05)；chemerin+TNF-a+L-NAME组VCAM-1和NF-κB蛋白表达水平较chemerin+TNF-α组也升高(P<0.05)。结论：(1)在HUVECs中,TNF-α通过NF-κB通路上调VCAM-1的表达；Chemerin可通过抑制TNF-α导致的NF-κB的磷酸化下调VCAM-1的表达；Chemerin对TNF-α诱导内皮细胞损伤模型起抗炎作用；Chemerin的抗炎作用是通过PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路介导的。(2)Chemerin可能是以后研究子痫前期等血管疾病的重要靶点.
【作者】王丽琼；
【导师】丁依玲；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】子痫前期；脂肪因子；chemerin；代谢综合征；eNOS；人脐静脉内皮细胞(HUVECs)；原代培养；鉴定；一氧化氮(NO)；信号传导；肿瘤细胞坏死因子(TNF-α)；

【参考文献】
[1]李先之.光在商业空间应用与研究[D].湖南师范大学,设计艺术学,2013,硕士.
[2]章小辉.村落景观格局演变驱动力及其机制研究[D].华中师范大学,土地资源管理,2014,硕士.
[3]张蕾,何小荣,陈丙珍.常减压装置生产数据的聚类分析[J].计算机与应用化学,2003,Z1:143-147.
[4]黄益明,伍凯,唐文涛,莫奇磊,熊素彬.纳米技术在口服难溶性药物的研究进展[J].中南药学,2013,05:362-365+398.
[5]蓝维旱.传输线分布参数特性研究及优化算法应用[D].广东工业大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[6]马红邑.西学的恶化对中国早期现代化的影响[D].山东大学,政治学理论,2013,硕士.
[7]郭锡伟.甜菜M14品系pBI/Pbm/BvM14-MADSbox载体的构建及BvM14-CMO、BvM14-BADH盐胁迫应答分析[D].黑龙江大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[8]贾云艳.基于高速摄像技术微型土槽试验台的研制[D].吉林农业大学,农业工程（专业学位）,2014,硕士.
[9]段辉娜.信息技术在农业产业化经营中应用的对策研究[D].河北农业大学,2004.
[10]上官鹏鹏.提高赤铁矿光电化学氧化水性能的研究[D].浙江工业大学,2013.
[11]刘万德,苏建荣,李帅锋,郎学东,张志钧,黄小波.云南普洱季风常绿阔叶林优势物种不同生长阶段叶片碳、氮、磷化学计量特征[J].植物生态学报,2015,01:52-62.
[12]李燕.乌兰布和沙漠水汽热耦合运移规律及植被生态学意义[D].长安大学,地下水科学与工程,2013,硕士.
[13]高鸣宇.潜江市“盛世龙城”房地产项目营销模式研究[D].华中师范大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[14]周坤玲.四足仿生机器人高速步态规划方法研究[D].北京交通大学,机械工程（专业学位）,2013,硕士.
[15]吴腾宇.中国科技市场成熟度研究[D].中国政法大学,政治经济学,2013,硕士.
[16]柳齐.基于动作序列识别的挖掘机智能节能方法研究[D].华侨大学,车辆工程,2014,硕士.
[17]卓杰.基于Powerlink的热网监控系统设计与实现[D].内蒙古科技大学,控制理论与控制工程,2014,硕士.
[18]黎向华.入侵检测与校园网络安全研究[D].湖南大学,计算机技术,2011,硕士.
[19]雷超.电流型NO_X传感器Pt/YSZ泵氧电极制备工艺与性能研究[D].华中科技大学,材料学,2013,硕士.
[20]康兴斌,康玉文.基于FPGA的DVI程序设计与开发[J].漳州职业技术学院学报,2014,02:21-25.
[21]王冉冉.基于OFDMA的无线视频传输跨层调度算法研究[D].南京邮电大学,信号与信息处理,2013,硕士.
[22]王胜.BOFOG新技术应用和控制[J].冶金自动化,2006,03:34-38.
[23]罗勇军.流化床富氧燃烧试验和成灰特性研究[D].哈尔滨工业大学,热能工程,2013,硕士.
[24]张锐,朱亚彬,毕玉,廖陆峰.有序ZnO纳米阵列的制备及其光学特性[J].光学学报,2014,06:320-324.
[25]王锐.论元代清丽派散曲[D].西北师范大学,古代文学,2003,硕士.
[26]李泊城.石涛绘画题跋书法研究[D].西南大学,美术学,2013,硕士.
[27]董莹.“三化”视角下滑县社会主义新农村建设研究[D].浙江海洋学院,农业推广（专业学位）,2013,硕士.
[28]王光明,姜良纲.中国有座鲁西监狱[J].人民文学,2001,12:3-105.
[29]许骥骏.中小市值上市公司现金股利分配比例分析[D].南京农业大学,工商管理,2012,硕士.
[30]郭遂波.浙江汉代堆塑罐的造型装饰与实质内涵[D].杭州师范大学,艺术学,2007,硕士.
[31]丁正乙.改造设备降低能耗[J].有色金属(选矿部分).1992(04)
[32]张常群,杨屹,苏建茹,郭广生,柯以侃.深化教学改革,建设国家级一流工科化学教学基地[J].高等工程教育研究.2002(06)
[33]余文.我国信托公司盈利能力影响因素研究[D].西北大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[34]张官亮.基于图理论的点模式匹配在图像匹配中的方法研究[D].国防科学技术大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[35]张雅楠.0-3岁早期教育机构的问题与对策研究[D].内蒙古师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[36]唐晓茜.多传感器螺栓预紧检测方法研究[D].浙江工业大学,2009.
[37]张嫚.云计算产业发展的专利对策研究[D].华中科技大学,知识产权管理,2012,硕士.
[38]吕蒙.基于时变Copula与MCMC方法的债券市场风险实证研究[D].广西师范大学,应用统计,2013,硕士.
[39]王勇平.TH公司基于财务视角的企业可持续增长研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[40]刘卫娟.负载型SBA-15催化剂用于正己醇催化氧化合成正己醛的研究[D].西北大学,化学工程,2014,硕士.
[41]杭的平.4000kN·m能级强夯黄土边坡动态响应规律的研究[D].中北大学,工程力学,2014,硕士.
[42]王怀泉.基于生物量法安太堡矿不同复垦模式乔木碳汇量研究[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[43]杨万能.水稻产量相关性状参数自动提取的数字化技术研究[D].华中科技大学,2011.
[44]陈婷.集合信托产品宏观风险和微观管理研究[D].苏州大学,金融（专业学位）,2014,硕士.
[45]AlvaradoGonzalezJuan.体育报道对何塞·穆里尼奥与皇家马德里队关系的影响研究[D].河北大学,新闻传播（专业学位）,2014,硕士.
[46]郑仲征.HLA样品信息管理系统设计与实现[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[47]范明,牛常勇,朱琰.一种挖掘多维关联规则的有效算法[J].计算机科学,2001,11:44-47.
[48]焦居仁,蒲朝勇.水土资源与土地沙漠化防治[J].中国水利.2002(10)
[49]李江勤.欠发达地区农地流转的“不确定性”分析[D].安徽大学,社会学,2014,硕士.
[50]张金海.广东国际光电采购中心项目投资效益研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.