熊果酸调节胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号的分子机制研究

【摘要】第一部分熊果酸(Ursolicacid,UA)对胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号的影响目的：(1)探讨UA对C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中胰岛素刺激mTOR信号的影响；(2)探讨UA对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中胰岛素刺激mTOR信号的影响；(3)探讨UA对C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中亮氨酸刺激mTOR信号的影响；(4)探讨UA对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞中亮氨酸刺激mTOR信号的影响。方法：(1)血清饥饿的C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10nM胰岛素共处理10分钟,WesternBlot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)血清饥饿的分化成熟3T3-L1脂肪细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10nM胰岛素共处理10分钟,WesternBlot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(3)血清饥饿的C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达；(4)血清饥饿的分化成熟3T3-L1脂肪细胞分别被给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mmM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测细胞内S6K和4E-BP1的磷酸化水平及蛋白质表达。结果：(1)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制C2C12肌原细胞和分化成熟的C2C12肌管细胞中胰岛素对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(2)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制分化成熟3T3-L1脂肪细胞中胰岛素对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(3)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制C2C12细胞和分化成熟C2C12肌管细胞中亮氨酸对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导；(4)与对照组相比,UA呈剂量依赖性抑制分化成熟3T3-L1脂肪细胞中亮氨酸对S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46磷酸化水平的诱导。结论：UA抑制C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中胰岛素和亮氨酸对S6K和4E-BP1磷酸化水平的诱导。第二部分PI3K/Akt途径在UA抑制胰岛素和亮氨酸刺激mTOR信号中的作用目的：(1)探讨PI3K/Akt途径是否参与UA对胰岛素刺激mTOR信号的抑制；(2)探讨PI3K/Akt途径是否参与UA对亮氨酸刺激mTOR信号的抑制。方法：(1)无血清培养C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞,分别给予不同浓度的UA预处理60分钟,跟随用或不用10nM胰岛素共处理10分钟,WesternBlot检测细胞内Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)无血清培养C2C12肌原细胞,用或不用100nMWortmannin预处理60分钟,跟随50μMUA共处理60分钟,然后用或不用10nMInsulin处理10分钟,WesternBlot检测细胞内S6K在Thr389,4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及Akt在Thr308的磷酸化水平和蛋白质表达；(3)无血清培养C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞,分别给予不同浓度的UA干预60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测细胞内Akt在Thr308和Ser473的磷酸化水平及蛋白质表达；(4)无血清培养PDK1knockout(KO)/wildtype(WT)MEFs细胞,用或不用50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测细胞内S6K在Thr389以及4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白质表达。结果：(1)UA处理明显抑制C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中胰岛素对Akt在Thr308和Ser473磷酸化水平的诱导；(2)P13K抑制剂Wortmannin明显抑制C2C12肌原细胞中胰岛素对S6K在Thr389、4E-BP1在Thr37/46及Akt在Thr308的磷酸化水平的诱导,但UA对其S6K和4E-BP1磷酸化水平不具有进一步的抑制效应；(3)熊果酸和亮氨酸对C2C12细胞和3T3-L1脂肪细胞中Akt的磷酸化水平没有明显影响；(4)亮氨酸明显诱导PDK1KO/WTMEFs细胞中S6K在Thr389的磷酸化水平,UA处理明显抑制了亮氨酸对PDK1KO/WTMEFs细胞中S6K在Thr389磷酸化水平的诱导。结论：UA主要通过抑制PI3K/Akt信号通路而抑制胰岛素对mTOR活性的诱导；UA抑制亮氨酸对mTOR活性的诱导不依赖于PI3K/Akt信号通路。第三部分TSC1/2-Rheb信号通路和mTOR与Raptor/Deptor相互作用在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用目的：(1)探讨UA是否通过TSC1/2依赖性抑制亮氨酸对mTOR活性的诱导；(2)探讨UA抑制亮氨酸诱导的mTOR激活是否依赖于Rheb;(3)探讨UA是否通过影响mTORC1蛋白质表达而抑制亮氨酸刺激的mTOR激活；(4)探讨UA是否通过影响mTOR与Raptor/Deptor相互作用而抑制亮氨酸对mTOR信号的激活作用。方法：(1)无血清培养TSC1/2KO/WTMEFs细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测S6K在Thr389和4E-BP1在Thr37/46的磷酸化水平及蛋白质表达；(2)无血清培养对照质粒、RhebWT和Rhebs16H过表达的C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测S6K在Thr389的磷酸化水平及蛋白质表达；(3)无血清培养Deptor沉默的和对照的C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测S6K在Thr389的磷酸化水平；(4)无血清培养C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,使用抗mTOR抗体免疫沉淀mTOR,通过WesternBlot检测细胞内mTOR,Raptor,Deptor和Tubulin水平以及免疫沉淀物中mTOR,Raptor和Deptor的水平。结果：(1)TSC1/2敲除明显增加S6K在Thr389磷酸化水平,亮氨酸处理进一步增加TSCl/2敲除的MEFs细胞中S6K磷酸化水平,UA明显抑制TSCl/2敲除的MEFs细胞中亮氨酸对S6K磷酸化的诱导；(2)C2C12细胞中RhebWT和Rhebs16H过表达明显增加S6K在Thr389的磷酸化水平,亮氨酸进一步促进这些细胞中S6K磷酸化水平,尽管UA没有抑制RhebWT和Rhebs16H过表达引起的S6K磷酸化增加,但是它抑制了亮氨酸对S6K磷酸化的诱导；(3)Deptor敲减明显增加S6K在Thr389的磷酸化水平,但亮氨酸处理进一步增加Deptor敲减的C2C12细胞中S6K磷酸化水平,UA明显抑制亮氨酸对Deptor敲减的C2C12细胞中S6K磷酸化水平的诱导；(4)UA没有影响C2C12细胞中mTOR,Raptor和Deptor等蛋白质的表达,UA没有干扰mTOR与Raptor/Deptor之间的相互作用。结论：UA抑制亮氨酸刺激的mTOR激活不依赖TSC1/2-Rheb通路；UA不通过影响mTORC1蛋白质表达和mTOR与Raptor/Deptor之间相互作用而抑制亮氨酸对mTOR信号的诱导。第四部分RagB在UA抑制亮氨酸刺激mTOR激活中的作用目的：(1)探讨RagB是否介导UA对亮氨酸刺激mTOR信号的抑制；(2)探讨UA是否影响RagB与Raptor之间的相互作用；(3)探讨UA是否抑制mTOR在溶酶体中的定位。方法：(1)无血清培养对照质粒、RagBWT和RagBQ99L过表达的C2C12细胞,分别给予50μMUA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测S6K在Thr389的蛋白质表达和磷酸化水平；(2)无血清培养RagB沉默的和对照的C2C12细胞,给予501μMUA预处理60分钟,跟随10mmM亮氨酸共处理60分钟,WesternBlot检测S6K在Thr389的磷酸化水平和蛋白质表达；(3)无血清培养RagB过表达的C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随用或不用10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞通过交联剂DSP处理,免疫沉淀Raptor,使用WesternBlot检测免疫沉淀物中Raptor和RagB的水平；(4)无血清培养RagB过表达的C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞通过交联剂DSP处理,免疫沉淀Flag-RagB,WesternBlot检测免疫沉淀物中Flag-RagB和Raptor的表达；(5)无血清培养C2C12细胞,给予50μMUA预处理60分钟,跟随10mM亮氨酸共处理60分钟,细胞用抗mTOR和抗LAMP1抗体孵育,共聚焦免疫荧光显微镜观察mTOR在溶酶体中的定位。结果：(1)RagBWT过表达对S6K磷酸化水平没有明显影响,但增强了亮氨酸对S6K在Thr389磷酸化的诱导,UA明显抑制了亮氨酸对mTORCl活性的诱导；RagBQ99L明显促进基础水平的S6K磷酸化,但亮氨酸处理没有进一步增强S6K磷酸化水平,UA明显抑制RagBQ99L过表达细胞中S6K磷酸化水平；(2)UA对RagB沉默的C2C12细胞中亮氨酸刺激的mTOR信号没有明显影响；(3)免疫共沉淀实验显示亮氨酸明显促进RagB与Raptor之间的相互作用,UA明显抑制这种相互作用；(4)共聚焦免疫荧光实验显示亮氨酸增加mTOR与溶酶体标志物LAMP1的共定位,UA的处理抑制了mTOR与LAMP1的共定位。结论：RagB介导UA对亮氨酸诱导mTOR信号的抑制；UA通过干扰RagB与Raptor之间的相互作用并阻止mTOR在溶酶体中的定位而抑制亮氨酸刺激mTOR的激活。
【作者】欧翔；
【导师】刘峰；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】熊果酸；胰岛素；亮氨酸；mTOR；C2C12；3T3-L1；PDK1；TSC1/2；Rheb；Raptor；Deptor；RagB；溶酶体；

【参考文献】
[1]李方.中国兰快繁技术与推广应用研究[D].浙江大学,农业推广,2004,硕士.
[2]崔蕾.新旧HSK考试大纲对比研究与全项应试辅导[D].河北师范大学,语言学及应用语言学,2013,硕士.
[3]牟若森.基于ERM框架的K公司内部控制体系优化研究[D].山东大学,会计（专业学位）,2013,硕士.
[4]张柏青,程榕,杨阿三,孙勤,郑燕萍,李俊.草甘膦铵盐干燥过程的设计与应用[J].农药,2013,04:252-254.
[5]董磊.微博打拐的虚拟社会动员及社会管理研究[D].哈尔滨工业大学,社会学,2013,硕士.
[6]舒怀林.PID神经元网络多变量控制系统分析[J].自动化学报,1999,01:108-114.
[7]韩江霞.医疗费用支付影响因素差异性研究[D].吉林大学,管理科学与工程,2014,硕士.
[8]薛菲.论国际商事仲裁实体法律适用的特点及新发展[D].华东政法学院,国际经济法,2003,硕士.
[9]姚建仁,刘连馥.绿色食品工程的理论基础与生命力[J].科技导报.1991(03)
[10]黄秋艳.基于主题的增量网页并行爬取问题研究[D].山东大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[11]胡浩.螺纹联接件参数化CAD系统研究[D].西南交通大学,车辆工程,2013,硕士.
[12]李晖,魏玲.全球光传送网络及设备的发展与趋势[J].现代电信科技.2007(11)
[13]朱丹.任丘辛安庄音乐会调查研究[D].河北大学,艺术学,2014,硕士.
[14]霍伟.均相钌催化解聚木质素模型化合物中β-O-4键的研究[D].中国科学技术大学,有机化学,2014,硕士.
[15]怀钰卓.酵素菌对鸡粪—秸秆的联合处理研究[D].吉林农业大学,环境工程,2012,硕士.
[16]蒋燕君.单相两级式光伏并网功率变换器的研究[D].浙江大学,2006.
[17]潘霆.探讨血清骨源性碱性磷酸酶（BALP）及尿Ⅰ型胶原交联氨基末端肽（uNTX）的表达在实体瘤骨转移诊治中的临床意义[D].苏州大学,病理学与病理生理学,2014,硕士.
[18]杨淑霞,高江云.心叶凹唇姜的开花格局和雄性先熟机制[J].植物生态学报,2009,03:449-459.
[19]刘欣.ZnO微纳米结构的CVD法生长及其在压电应力传感器中的应用[D].大连理工大学,微电子学与固体电子学,2013,硕士.
[20]寇玲玲.家庭暴力的社会工作干预模式研究[D].福建师范大学,社会工作（专业学位）,2012,硕士.
[21]朱明,成长生.数据库技术与Web结合实现网上商品信息的采集[J].东华大学学报(自然科学版),2002,02:44-47.
[22]何桂立.关于气味信息传输的探讨[J].电信网技术.2001(01)
[23]李松虎.黄河下游城市（济南）饮用水管网生物稳定性及影响因素研究[D].青岛理工大学,环境科学,2012,硕士.
[24]黄永平,夏代学,秦鑫,夏建军.高分辨率三维地震勘探技术在莫北2井区的应用[J].石油地球物理勘探,2002,S1:75-78+221.
[25]田智蕊.大豆PR-5蛋白GmOLPa基因的克隆与原核表达[D].吉林农业大学,生物化学与分子生物学,2012,硕士.
[26]刘洁.基于GeM模型的微博语篇结构研究[D].杭州师范大学,汉语言文字学,2013,硕士.
[27]宋竹芳.我国旅游文化产业园区发展路径、模式及开发效应研究[D].西北大学,旅游管理,2013,硕士.
[28]李晶.武陵源核心景区旅游业扩容提质研究[D].湖南师范大学,人文地理学,2014,硕士.
[29]谢芳华,张炜.客户关系管理与网络营销及其技术支持[J].成组技术与生产现代化,2003,02:33-36.
[30]马建军,孙勇,蒋俊,李长岭,王建安.冠状动脉慢性完全闭塞病变开通后支架内慢性完全闭塞病变经皮冠状动脉介入治疗效果及失败原因分析[J].实用心脑肺血管病杂志,2014,05:30-31.
[31]KennethLukeMaindi.金融危机爆发的原因及影响分析[D].吉林大学,金融学,2014,硕士.
[32]朱瑞可,李兴源,赵睿,李宽.矩阵束算法在同步电机参数辨识中的应用[J].电力系统自动化,2012,06:52-55+84.
[33]梁娟.现代成本管理模式研究[D].东南大学,2004.
[34]刘经喆.TESCO中国地产公司发展战略研究[D].首都经济贸易大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[35]郑乃校.论我国电信业的反垄断法规制[D].黑龙江大学,法律,2013,硕士.
[36]于欢.清初传教士安文思、利类思在京活动研究[D].首都师范大学,专门史,2013,硕士.
[37]张竟飞.面向不平衡负荷的无功功率补偿研究与设计[D].西安电子科技大学,电机与电器,2012,硕士.
[38]孟宪福.Heusler合金的组织结构与热电性能[D].哈尔滨工业大学,材料物理与化学,2013,硕士.
[39]杨峰,孙莉,汪湲.电力企业信息化新技术研究―数据仓库[J].山东电力技术,2005,06:65-68.
[40]周良杰.整型权值神经网络的性能分析[D].杭州电子科技大学,计算机应用与技术,2011,硕士.
[41]陈敏云.维甲酸诱导内耳祖代细胞分化的研究[D].福建医科大学,耳鼻咽喉科学,2014,硕士.
[42]李智博.鞍山市劳动监察机构执法程序优化研究[D].吉林大学,工业工程,2014,硕士.
[43]杨晨.中产梦—杜拉拉热的解读[D].广西民族大学,文艺学,2013,硕士.
[44]师亮.湖南艺术职院绩效预算管理优化研究[D].湖南大学,会计,2010,硕士.
[45]山昊.Instlink系统集群的设计与实现[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[46]温芳.鸡体内硫酸粘杆菌素残留检测微生物学方法和消除规律研究[D].中国农业大学,基础兽医学,2004,硕士.
[47]王超.我国小产权房法律规制研究[D].河北经贸大学,经济法,2013,硕士.
[48]陈阳.什么是价值的社会依赖性[D].中国政法大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[49]吴贤杰.毛囊器官培养模型的应用研究及含毛囊人工皮肤的研制[D].浙江大学,皮肤病与性病学,2004,硕士.
[50]张婧.工业设计中的色彩情感导向性研究与实践[D].重庆大学,艺术（专业学位）,2014,硕士.