MiR-142-5p高表达及抑制小鼠骨折模型建立及表型分析

【摘要】第一部分MiR-142-5p高表达或抑制转基因小鼠模型的建立目的：建立miR-142-5p在骨组织内特异性高表达及抑制的转基因小鼠模型,以进一步分析miR-142-5p在小鼠体内对骨折愈合的影响。方法：(1)、首先合成pre-miR-142和miR-142-5psponge序列,序列两端包含SalⅠ和EcoRⅠ酶切位点,插入到本实验室保存的含骨钙素启动子的表达质粒(pOG2-Cre-hGH)中,替换原质粒的Cre序列。构建好的质粒分别命名为Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S,经测序及酶切后电泳验证；(2)在MC3T3-E1前成骨细胞株中分别转染Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S质粒,使用含抗坏血酸及β-甘油磷酸钠的培养液诱导成骨分化72h,使用PCR法检测细胞内miR-142-5p表达水平变化；(3)将Bglap-pre-miR-142和Bglap-miR-142-S表达质粒通过显微注射的方法注射到C57BL/6小鼠的受精卵原核内,待小鼠出生后3周使用PCR法鉴定表达质粒已整合到小鼠基因组中；(4)使用PCR法检测miR-142-5p和miR-142-5psponge转基因小鼠不同组织内的miR-142-5p表达,验证两种小鼠是否存在骨组织特异性的miR-142-5p表达增加或降低。结果：1、成功构建了含骨钙素启动子的pre-miR-142-5p和miR-142-5psponge表达质粒,其能在MC3T3-E1细胞向成骨细胞分化过程中表达,并导致细胞内miR-142-5p增加或降低；2、成功构建了骨组织特异性表达的pre-miR-142-5p和miR-142-5psponge转基因小鼠,可导致骨组织特异性miR-142-5p表达增加或降低。结论：成功构建了骨组织特异性miR-142-5p高表达或抑制的转基因小鼠模型,为下一步体内研究miR-142-5p在骨折愈合过程中的作用奠定了基础。第二部分MiR-142-5p高表达或抑制转基因小鼠模型的骨折表型分析目的：研究体内骨组织特异性miR-142-5p高表达或抑制对骨折愈合的影响,探讨miR-142-5p在骨折愈合中的作用机制。方法：(1)、使用单侧开放性股骨干横形骨切开术并锁钉内固定法,在野生型、rniR-142-5p骨组织特异性高表达型以及miR-142-5p骨组织特异性抑制型转基因小鼠中构建骨折模型；(2)、使用X线摄片、组织切片HE染色检测转基因小鼠骨折后7d、14d、21d的骨折愈合情况,观察miR-142-5p高表达或抑制对骨折愈合的影响；(3)、使用qRT-PCR法检测转基因小鼠骨折后0d、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨钙素表达水平,观察其表达模式；(4)、使用qRT-P(CR及WesternBlot法检测转基因小鼠骨折部位WWP1的表达,在体内验证WWP1为miR-142-5p的靶基因。结果：1、成功在野生型、miR-142-5p骨组织特异性高表达型及抑制型转基因小鼠中构建骨折模型。2、X线摄片显示,在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,骨折愈合速度较WT型明显加快,而在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,骨折愈合速度较WT则明显下降。3、组织HE染色显示,在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,骨痂的钙化、编织骨的形成及塑形完成较WT明显增快,而在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,骨痂的钙化、编织骨的形成较WT则明显下降。4、在WT小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平在骨折后21天达到高峰；而在miR-142-5p骨组织特异性高表达小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平表达增加且在骨折后14天即达到高峰；在miR-142-5p骨组织特异性抑制小鼠,miR-142-5p及骨钙素水平较野生型显著下降。5、在小鼠中,骨折部位WWP1mRNA的表达水平随着骨折后时间延长均呈显著上升趋势,并在骨折后21天达到高峰,在miR-142-5p抑制型转基因小鼠上升较WT小鼠更显著。结论：miR-142-5p骨组织特异性高表达可以促进骨折愈合,而miR-142-5p骨组织特异性抑制则延缓骨折愈合,miR-142-5p在动物模型骨折愈合过程中仍然通过靶基因WWP1发挥作用。第三部分MiR-142-5p对衰老小鼠骨折愈合的治疗作用目的：建立衰老小鼠骨折模型,观察agomir-142-5p对衰老小鼠骨折愈合的治疗作用。方法：(1)、在18月龄的C57BL/6小鼠中行单侧股骨骨干横形骨切开术并锁钉内固定,构建衰老小鼠骨折模型；(2)、使用qRT-PCR法检测衰老小鼠骨折后Od、7d、14d、21d、28d的miR-142-5p及骨钙素表达,观察其表达模式；(3)、在骨折部位注射miR-142-5p拟似物agomir-142-5p,观察衰老小鼠骨折后28d的X线表现；(4)、用组织HE染色法,观察agomir-142-5p干预后衰老小鼠骨折后28d的骨折愈合情况。结果：1、成功构建衰老小鼠骨折模型,并发现与年轻小鼠相比,衰老小鼠骨折后各个时期骨折部位miR-142-5p的表达均显著降低。此外,衰老小鼠骨折后miR-142-5p的表达高峰延迟到骨折后28d。2、在衰老小鼠,骨折后各个时期骨折部位骨钙素的表达水平较年轻小鼠均显著降低。3、骨折后28天,注射PBS或Agomir对照的衰老小鼠X线摄片仍可见模糊骨折线,骨痂量少,而在Agomir-142-5p注射的衰老小鼠,可见骨折线消失,骨痂较大,密度高。4、在agomir-142-5p注射小鼠,28天时可见骨痂钙化,部分连接成片,编织骨形成。而在agomircontrol及PBS注射小鼠,骨折后28天仅可见较多纤维性骨痂及软骨性骨痂,部分钙化。结论：Agomir-142-5p骨折部位局部注射能够促进骨折愈合,改善衰老小鼠骨折愈合延迟。
【作者】程鹏；
【导师】罗湘杭；
【作者基本信息】中南大学，内科学，2014，博士
【关键词】microRNA；转基因；骨特异性；骨折；WWP1；靶基因；衰老；Agomir；骨折愈合延迟；

【参考文献】
[1]田龙.网页实时防篡改系统的研究[D].西安工业大学,计算机软件与理论,2014,硕士.
[2]王晓.非诉讼方式在农村民事纠纷解决中的运用[D].曲阜师范大学,马克思主义基本原理,2013,硕士.
[3]罗时照.灭火救援指挥管理系统的分析与设计[D].云南大学,软件工程,2012,硕士.
[4]张学广,王瑞,刘鑫龙,徐殿国.改进的主动频率偏移孤岛检测算法[J].电力系统自动化,2012,14:200-204+209.
[5]万利军.钢—砼叠合梁自锚式悬索桥静动力特性模型试验研究[D].东北林业大学,森林工程,2013,博士.
[6]吴秀珍.战后台湾农业技术推广体系研究[D].华中师范大学,地方政府学,2013,硕士.
[7]刘志刚.试论“文革”前十年文化建设的历史经验[D].湖南师范大学,中共党史,2004,硕士.
[8]吴喜元.乳胶涂料用聚丙烯酸酯乳液的合成及性能研究[D].陕西科技大学,轻工技术与工程,2013,硕士.
[9]商鹏龑.职业经理人阶层在劳资关系中的角色研究[D].福建师范大学,社会保障,2012,硕士.
[10]王昊.多传感器信息融合在塔机定位中的应用研究[D].太原科技大学,检测技术与自动化装置,2013,硕士.
[11]娄婧婧.中原地区传统典型木质农耕器具研究[D].中南林业科技大学,设计艺术学,2013,硕士.
[12]吴云峰.滋水涵木饮治疗肝肾阴虚型肾性骨病的临床疗效观察[D].黑龙江中医药大学,中医内科学（专业学位）,2014,硕士.
[13]霍瑞霞.分子在纳米孔道内扩散行为的研究[D].中北大学,2010.
[14]水黎明.高脂血症遗传与环境影响因素分子流行病学研究[D].浙江大学,2002.
[15]郭惠昕.基于模糊集的证据组合方法及其应用[J].控制与决策,2008,02:229-232.
[16]汪璇.基于粗糙集理论的农业数据库知识发现研究[D].西南农业大学,农业机械化工程,2004,硕士.
[17]熊霞.香蒲（Typha angustifolia）地上部合理收获及其肥料化利用技术[D].安徽大学,环境工程,2014,硕士.
[18]王炯莲.基于嵌入式系统的便携电磁辐射计的设计与实现[D].苏州大学,电子与通信工程（专业学位）,2013,硕士.
[19]范雷.山东省中西部农村居民生活方式综合干预血压控制效果分析[D].济南大学,流行病与卫生统计学,2012,硕士.
[20]陈明远.我国上市公司内部控制评价研究[D].山东财经大学,会计学,2013,硕士.
[21]蒋沛.超声波电视测井仪[J].冶金自动化,1981,06:26-29.
[22]吴琼.高校中国梦宣传教育的话语策略[J].思想理论教育导刊,2015,01:114-117.
[23]李宽.大尺度环流相互作用研究与模式下边界条件估计研究[D].兰州大学,应用数学,2014,硕士.
[24]黄茜.软式内镜清洗刷对生物膜清除效果的调查与实验研究[D].南方医科大学,护理学,2012,硕士.
[25]何堃,张朝池.具有不可测输入的线性系统观测器[J].自动化学报,1983,03:199-204.
[26]向加茂.网络时代我国政府舆论危机处理能力提升策略研究[D].华中师范大学,公共管理（专业学位）,2013,硕士.
[27]黄江,马永光.基于Agent的智能决策支持系统[J].信息技术,2003,03:46-48+96.
[28]杨晓莉.宫泽贤治童话在中国的介绍和翻译[D].厦门大学,日语语言文学,2014,硕士.
[29]周蓉.《森林动态理论─—森林演替模型的生态学原理》一书简介[J].植物生态学报,1994,01:103-104.
[30]刘晓.成人开腹手术术后静脉自控镇痛芬太尼消耗量的影响因素分析[D].广西医科大学,麻醉学（专业学位）,2013,硕士.
[31]陈健.国内高校教学楼组群的两种典型模式比较研究[D].浙江大学,建筑设计及理论,2004,硕士.
[32]段春龙.闭孔泡沫铝表层轧实成形的研究[D].燕山大学,机械设计及理论,2013,硕士.
[33]徐世凡.烟尘浓度空间分布规律研究[D].西安工业大学,电子与通信工程,2014,硕士.
[34]陈一.无机/有机纳米复合刺激响应水凝胶的制备与表征[D].湖南大学,化学工程与技术,2014,博士.
[35]王付胜,邵章平,张兴,刘萍,任康乐.多机T型三电平光伏并网逆变器的环流抑制[J].中国电机工程学报,2014,01:40-49.
[36]宋晴.新型三元杂化材料的制备与性能研究[D].安徽大学,材料工程,2012,硕士.
[37]石楠.活性放线菌的多相分类[D].河北大学,微生物学,2003,硕士.
[38]芮婷.新疆乌什塔拉地区泥盆纪地层特征及沉积环境分析[D].长安大学,构造地质学,2014,硕士.
[39]时永玲.《醒来的森林》和《冬日阳光》的生态解读[D].郑州大学,英语语言文学,2013,硕士.
[40]梁毅.光子晶体带隙结构及色散性质的研究[D].山东建筑大学,凝聚态物理,2012,硕士.
[41]张晓宁,戴青.基于数据挖掘的分布式入侵检测系统研究[J].无线电工程,2004,09:19-21+45.
[42]郑河.YQ-FC有限公司成都有色铸造分公司核心业务流程设计[D].吉林大学,工业工程,2013,硕士.
[43]刘顺心.彩涂生产线炉子控制系统[J].冶金自动化,2007,03:36-39.
[44]丁宏恩,高宗和,苏大威,赵家庆,常乃超,龚成明.混合量测状态估计相角参考点坏数据问题的处理方法[J].电力系统自动化,2014,09:132-136.
[45]罗海.关于Zigbee技术在公共建筑节能领域应用的探讨[D].浙江工业大学,2012.
[46]王慧娴,张辉.市场主导视角下的中国旅游业多主体改革研究[J].经济问题,2014,10:122-129.
[47]李波.金属蛋白酶ADAMTS-7在肺动脉高压发病机制中的作用研究[D].南方医科大学,临床医学（专业学位）,2014,博士.
[48]蒋海燕,戴洪兴,孟雪,张磊,邓积光,吉科猛.单斜BiVO_4可见光催化降解甲基橙的形貌效应[J].催化学报,2011,06:939-949.
[49]朱建明.地铁车站热环境状态与隧道围岩传热的研究[D].北京交通大学,2014.
[50]周敏.金代苏轼诗词的传播方式研究[D].沈阳师范大学,中国古代文学,2013,硕士.