槟榔碱对口腔粘膜上皮细胞MMP-2及成纤维细胞CTGF表达影响的信号通路机制研究

【摘要】摘要第一章槟榔碱对原代培养口腔粘膜上皮细胞和成纤维细胞增殖、凋亡及DNA损伤作用的影响目的：研究槟榔碱对原代培养口腔粘膜上皮细胞和成纤维细胞增殖、凋亡及DNA损伤作用的影响。方法：体外培养、扩增口腔粘膜上皮和成纤维细胞,通过细胞形态学及角蛋白和波形丝蛋白免疫组织化学染色等鉴定细胞；MTT实验检测高浓度槟榔碱短时间干预及低浓度槟榔碱长时间作用对上皮细胞和成纤维细胞增殖的影响；流式细胞术分析槟榔碱干预对上皮细胞和成纤维细胞的细胞周期的影响；彗星实验检测槟榔碱对上皮细胞和成纤维细胞DNA损伤的影响。结果：所培养的细胞具有典型的上皮细胞和成纤维细胞形态,角蛋白和波形丝蛋白染色阳性。高浓度(0.2mM-0.8mM)槟榔碱短期(0-72小时)作用于上皮细胞和成纤维细胞后,上皮细胞随槟榔碱浓度的增加及作用时间延长而活力下降,形态变化明显,差异具有统计学意义(P<0.05)；成纤维细胞在槟榔碱作用后活力下降不明显及形态无明显改变,差异不具有统计学意义(P>0.05)。在对细胞周期影响方面,0.8mmM槟榔碱干预48小时导致了上皮细胞位于G2/M期的比例相比对照组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05),而对成纤维细胞周期的改变影响不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。0.6mM槟榔碱干预24小时可诱导上皮细胞出现凋亡,呈现剂量和时间的依赖性,差异具有统计学意义(P<0.05)；但诱导成纤维细胞凋亡作用不明显,差异不具有统计学意义(P>0.05)。低浓度槟榔碱显著抑制上皮细胞生长的条件是0.1mM作用12天后,差异具有统计学意义(P<0.05)；此浓度槟榔碱干预相同时间对成纤维细胞生长影响无明显影响,差异不具有统计学意义(P>0.05)。各浓度槟榔碱作用成纤维细胞24小时后,成纤维细胞DNA损伤情况与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)；上皮细胞DNA损伤情况与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05),且与浓度呈依赖关系,浓度越高,DNA损伤越严重。结论：1、高浓度槟榔碱短时间干预能够抑制上皮细胞增殖,诱导上皮细胞凋亡,细胞周期在G2/M期发生阻滞,对DNA损伤作用呈剂效依赖关系。2、高浓度槟榔碱短时间干预对成纤维细胞增殖,凋亡及DNA损伤均无明显影响。3、低浓度槟榔碱干预到第12天后上皮细胞活细胞数明显下降,而成纤维细胞活细胞数无明显改变。第二章槟榔碱对口腔粘膜上皮细胞MMP-2表达的影响及其信号通路机制研究目的：探讨槟榔碱对口腔粘膜上皮细胞MMP-2表达的影响及其可能机制。方法：应用Westernblotting、RT-PCR和明胶酶谱法,检测高浓度槟榔碱(0.2mM-0.8mM)分别短时间(10分钟)和低浓度槟榔碱(0.1mM)长时间(24小时)处理口腔粘膜上皮细胞后MMP-2的表达。在O.1mM槟榔碱干预上皮细胞检测MMP-2表达前,用ERK、PI3K、p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信号通路抑制剂PD98059,LY294002,U0126,N-乙酰-L-半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC),SB203580,SP600125和Bayl1-7082分别预处理口腔粘膜上皮细胞,揭示槟榔碱影响上皮细胞MMP-2表达的信号通路机制。结果：高浓度槟榔碱(0.2mM-0.8mM)分别短时间(10分钟)处理口腔粘膜上皮细胞后,细胞继续培养12小时,与对照组相比MMP-2表达显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),且与槟榔碱具有浓度依赖性。低浓度槟榔碱(0.1mM)长时间(24小时)处理口腔粘膜上皮细胞后,细胞继续培养24小时,MMP-2表达显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。P13K信号通路抑制剂LY294002能够抑制低浓度(O.1mM)槟榔碱诱导MMP-2表达的能力,且呈浓度依赖性,而ERK信号通路抑制剂PD98059无此作用。p38MAPK、c-JNK和NF-κβ信号通路抑制剂SB203580、SP600125、Bay11-7082能抑制低浓度(0.1mM)槟榔碱诱导MMP-2表达的能力,而NAC和U0126则无此作用。结论：1、高浓度或低浓度槟榔碱长时间或短时间处理口腔粘膜上皮细胞都能导致MMP-2蛋白表达上调；2、低浓度槟榔碱长时间处理口腔粘膜上皮细胞诱导MMP-2蛋白表达上调的机制可能与PI3K、p38MAPK、c-JNK和NF-κβ等信号通路有关。第三章槟榔碱对口腔粘膜成纤维细胞CTGF表达影响的信号通路机制及姜黄素影响CTGF表达作用的研究目的：观察槟榔碱干预后口腔粘膜成纤维细胞CTGF的表达,探讨姜黄素拮抗槟榔碱诱导成纤维细胞CTGF表达的可能机制。方法：免疫组织化学法检测20例口腔粘膜下纤维性变患组织中CTGF表达情况。Westernblot检测槟榔碱长时间和短时间作用对口腔粘膜成纤维细胞CTGF表达的影响,以及使用PD98059(12.5、25、50μM)、SB203580(10μM)、SP600125(10μM)、Bay11-7082(10μM)和NAC(5mM)等信号通路抑制剂观察槟榔碱影响CTGF表达的信号机制。使用姜黄素干预并检测其对槟榔碱诱导口腔粘膜成纤维细胞CTGF表达上调作用的影响。结果：CTGF在口腔粘膜下纤维性变患者口腔粘膜组织中的表达显著高于正常粘膜组织,差异具有统计学意义(P<0.05)。不同浓度槟榔碱干预成纤维细胞后,Westernblot检测结果表明槟榔碱促进了CTGF表达,且O.1mmM的槟榔碱作用2小时后CTGF蛋白增加约2.5倍。O.1mM槟榔碱作用口腔粘膜成纤维细胞不同时间后,蛋白质印迹法检测结果表明口腔粘膜成纤维细胞中CTGF最高表达水平发生在O.1mM槟榔碱作用2小时时,此后下降。Westernblot检测不同信号通路抑制剂干预后CTGF表达,结果表明Bayll-7082、SP600125、SB203580和NAC等抑制剂显著的降低了槟榔碱诱导CTGF表达,但PD98059无此作用。蛋白质印迹实验结果表明姜黄素提前干预口腔粘膜成纤维细胞后,槟榔碱诱导口腔粘膜成纤维细胞CTGF表达减少,且姜黄素是以剂量依赖性的方式降低槟榔碱诱导的CTGF的表达,在姜黄素浓度达到10μM时,CTGF表达水平就已经低于正常对照组。结论：1、TGF在口腔粘膜下纤维性变组织中的表达显著高于对照组。2、槟榔碱诱导成纤维细胞CTGF表达增加作用呈剂效和时效依赖性,可能与NF-kβ、JNK、p38APK信号通路有关。3、姜黄素可以拮抗槟榔碱诱导成纤维细胞CTGF的表达。
【作者】李奉华；
【导师】彭解英；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】槟榔碱；上皮细胞；成纤维细胞；增殖；凋亡；DNA损伤；金属基质蛋白酶-2；信号通路；结缔组织生长因子；姜黄素；

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