β干扰素TIR结构域衔接蛋白（TRIF）在NOD小鼠1型糖尿病发病中的作用

【摘要】第一部分TRIF对NOD小鼠T1D发病的影响目的：(1)研究TRIF在NOD小鼠T1D发病中的作用；(2)探明TRIF对NOD小鼠胰岛功能的影响。方法：以野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠为研究对象。(1)通过尿糖检测,观察野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠自发性T1D的发病率；(2)通过过继转移年龄、性别、糖尿病病程匹配的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的脾细胞至三种不同的受试小鼠(包括半致死剂量照射的NOD小鼠,半致死剂量照射的TRIF-/-NOD小鼠和NOD.SCID小鼠),观察诱导性T1D的发病率；(3)采用Luminex法检测非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠血清中的抗胰岛素抗体；(4)采用经腹腔糖耐量实验(IPGTT)评价非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的糖耐量,放射免疫法测定IPGTT各时间点血清中胰岛素水平；(5)采用体外葡萄糖刺激实验评价非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的胰岛在糖刺激下胰岛素的分泌水平,放射免疫法测定胰岛素水平；(6)通过胰腺HE染色切片观察非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠胰岛淋巴细胞的浸润,进行胰岛炎评分。结果：(1)雌性TRIF-/-NOD小鼠(n=10)自发性T1D发病率低于野生型NOD小鼠(n=15)；雄性TRIF-/-NOD小鼠(n=12)自发性T1D发病率低于TRIF+/-NOD小鼠(n=17)。(2)过继转移模型中,接受了糖尿病TRIF-/-NOD小鼠脾细胞的三种不同的受试小鼠(包括半致死剂量照射的NOD小鼠,半致死剂量照射的TRIF-/-NOD小鼠和NOD.SCID小鼠)诱导性T1D发病显著延迟(P<0.01-0.05)。(3)雌性TRIF-/-NOD小鼠血清中抗胰岛素抗体阳性率显著低于野生型NOD小鼠(P<0.05)。(4)IPGTT提示TRIF-/-NOD小鼠糖耐量未受损(P<0.01),血清中胰岛素水平显著高于野生型NOD小鼠(P<0.05)。(5)体外葡萄糖刺激实验提示TRIF-/-NOD小鼠的胰岛在糖刺激下胰岛素分泌水平显著高于野生型NOD小鼠(P<0.05)。(6)TRIF-/-NOD小鼠浸润胰岛的淋巴细胞明显少于野生型NOD小鼠(P<0.05)。结论：(1)TRIF在NOD小鼠T1D发病中起重要作用,TRIF缺陷导致T1D发病延迟。(2)TRIF可通过促进胰岛炎的发生,增加胰岛p细胞免疫性损伤而降低胰岛p细胞功能。第二部分TRIF对NOD小鼠免疫细胞表型的影响目的：研究TRIF对NOD小鼠抗原递呈细胞(APCs)和T细胞表型的影响。方法：以12周龄雌性非糖尿病的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠为研究对象。(1)获取非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾和胰腺淋巴结(PLN)中的淋巴细胞,浸润胰岛的淋巴细胞,骨髓来源的细胞,磁珠分离纯化脾APCs;(2)脾淋巴细胞,脾APCs和骨髓来源的细胞分别以未加任何刺激物、加有TLR3激动剂PolyI:C及加有TLR4激动剂LPS的RPMI1640完全培养基悬浮并刺激过夜,次日洗涤待用；(3)流式细胞术检测细胞表面标记物,细胞内炎性因子及调节性T细胞的比例。结果：(1)与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠脾B细胞,脾单核巨噬细胞和树突状细胞(DCs)表面MHCII类分子(IAK)的表达明显降低(脾B细胞：PolyI:C刺激后P<0.01,LPS刺激后P<0.05,抗CD40单克隆抗体刺激后P<0.05；脾单核巨噬细胞和DCs:未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.05,LPS刺激后P<0.05)；与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠胰岛DCs表面IAK的表达亦明显降低(P<0.001)。(2)与野生型NOD小鼠相比,脾脏B细胞表面的CD86的表达明显下降(未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.001,LPS刺激后P<0.001)；TRIF-/-NOD小鼠脾单核巨噬细胞表面CD80的表达下降(未加刺激物P<0.05,LPS刺激后P<0.05),CD86的表达在PolyI:C和LPS刺激后明显下降(PolyI:C刺激后P<0.001,LPS刺激后P<0.01)；脾脏DCs表面CD86的表达在PolyI:C和LPS刺激后明显下降(PolyI:C刺激后P<0.001,LPS刺激后P<0.01)。与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠胰岛单核巨噬细胞表面CD80和CD86的表达均出现了明显下降(P均<0.05)；而骨髓来源的单核巨噬细胞和DCs表面CD86的表达在PolyI:C和LPS刺激后明显下降(PolyI:C刺激后P均<0.001,LPS刺激后P均<0.001)。(3)与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠脾脏单核巨噬细胞和DCs分泌的TNF-α水平尤其在PolyI:C和LPS刺激后明显减少(单核巨噬细胞：PolyI:C刺激后P<0.05,LPS刺激后P=0.06:DCs:未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.01,LPS刺激后P<0.01)。与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠脾脏单核巨噬细胞和DCs分泌的IFN-γ水平亦明显减少(单核巨噬细胞：未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.001,LPS刺激后P<0.01:DCs:未加刺激物P<0.01,PolyI:C刺激后P<0.001,LPS刺激后P<0.001)。(4)与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠骨髓来源的单核巨噬细胞和DCs表面CCR7的表达在PolyI:C和LPS刺激后明显降低(单核巨噬细胞：未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P=0.06,LPS刺激后P<0.01；DCs:PolyI:C刺激后P<0.01,LPS刺激后P<0.05)。(5)与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠脾,PLN及胰岛中CD4+T细胞表面CD69的表达明显降低(脾：P<0.05:PLN:P<0.05:胰岛：P<0.001):TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T细胞表面ICOS和CD40L的表达也明显降低(P均<0.05)。(6)与野生型NOD小鼠相比,TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T细胞所分泌的TNF-α,IFN-γ及IL-17尤其是在PolyI:C和LPS刺激后明显降低(TNF-α:未加刺激物P<0.01；IFN-γ:未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.05；IL-17:未加刺激物P<0.05,LPS刺激后P<0.001)。结论：TRIF影响APCs表面MHCII类分子和共刺激分子的表达及炎性因子的分泌,影响T细胞尤其是CD4+T细胞表面活化因子的表达和其炎性因子的分泌。第三部分TRIF对NOD小鼠免疫细胞功能的影响目的：研究TRIF对NOD小鼠APCs和T细胞功能的影响。方法：以12周龄雌性非糖尿病的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠为研究对象。(1)过继转移野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠骨髓中的单个核细胞分别给致死X线剂量照射过的TRIF-/-NOD小鼠和野生型NOD小鼠进行骨髓嵌合实验,观察T1D的发病率；(2)磁珠分离纯化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T细胞及NY8.3NOD小鼠的脾CD8+T细胞分别与野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾APCs,在不同浓度的mimotope和IGRP刺激下共培养,进行体外增殖实验,比较两组小鼠APCs的体外抗原递呈能力；(3)磁珠分离纯化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T细胞,CFSE标记后,静脉注射给野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠,三天后处死小鼠获取脾脏和PLN,流式检测BDC2.5CD4+细胞CFSE的衰减,比较两组小鼠APCs的抗原递呈能力；(4)磁珠分离纯化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T细胞与野生型NOD小鼠或TRIF-/-NOD小鼠脾APCs一起过继转移给NOD.SCID小鼠,观察T1D发病率,比较两组小鼠APCs的体内抗原递呈能力；(5)磁珠分离纯化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T细胞与不同刺激状态的骨髓源性的DCs(BMDCs)细胞在不同浓度的mimotope刺激下共培养,进行体外增殖实验,比较两组小鼠BMDCs的体外抗原递呈能力；(6)磁珠分离纯化得到野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T细胞和CD8+T细胞,与NOD小鼠的脾细胞在不同浓度的抗CD3抗体刺激下共培养,进行体外增殖实验,比较两组小鼠T细胞的体外增殖能力；(7)磁珠分离纯化得到野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T细胞和CD8+T细胞,两两组合后一起过继转移给NOD.SCID小鼠,观察T1D发病率,比较两组小鼠T细胞的体内增殖和致病能力。结果：(1)骨髓嵌合实验中,供体小鼠为野生型NOD小鼠,受试小鼠为接受致死剂量X线照射的TRIF-/-NOD小鼠T1D发病早于供体小鼠为TRIF-/-NOD小鼠,受试小鼠为接受致死剂量X线照射的野生型NOD小鼠(P<0.05)。(2)野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的APCs在不同浓度IGRP刺激下对NY8.3CD8+T细胞的抗原递呈能力相似(P>0.05)；但TRIF-/-NOD小鼠的APCs在10ng/ml(P<0.05)和100ng/ml(P<0.001)mimotope刺激下对BDC2.5CD4+T细胞的抗原递呈能力明显弱于野生型NOD小鼠的APCs。(3)CSFE标记的BDC2.5CD4+T细胞在TRIF-/-NOD小鼠脾脏和PLN中增殖强度弱于野生型NOD小鼠。(4)过继转移实验中,接受BDC2.5CD4+T细胞和TRIF-/-APCs的NOD.SCID小鼠T1D发病慢于接受BDC2.5CD4+T细胞和NODAPCs的NOD.SCID小鼠。(5)TRIF-/-NOD小鼠不同刺激状态下BMDCs的体外抗原递呈能力明显弱于野生型NOD小鼠(未加刺激物P<0.05,PolyI:C刺激后P<0.05,LPS刺激后P<0.01)。(6)TRIF-/-NOD小鼠CD8+T细胞的体外增殖与NOD小鼠无差异；而TRIF-/-NOD小鼠CD4+T细胞的增殖明显少于NOD小鼠(P<0.001-0.05)。(7)过继转移实验中,发病最快的是接受NODCD4+T细胞及NODCD8+T细胞的NOD.SCID小鼠,其次是接受NODCD4+T细胞及TRIF-/-CD8+T细胞的NOD.SCID小鼠,再次是接受TRIF-/-CD4+T细胞及NODCD8+T细胞的NOD.SCID小鼠,发病最慢、糖尿病发病率最低的是接受TRIF-/-CD4+T细胞及TRIF-/-CD8+T细胞的NOD.SCID小鼠,提示TRIF缺陷抑制T细胞特别是CD4+T细胞的体内增殖和致病能力。结论：TRIF可通过促进APCs的抗原递呈,导致CD4+T细胞的活化和增殖,诱发T1D。
【作者】超晨；
【导师】周智广；LiWen；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2013，博士
【关键词】TRIF；1型糖尿病；β细胞功能；胰岛炎；树突状细胞；MHCⅡ类分子；共刺激表达分子；T细胞活化；抗原提呈；T细胞活化增殖；

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