microRNA-376b-5p对脑缺血后血管新生的调控作用及机制研究

【摘要】背景和目的：脑梗死是一类发病率高、致残率高以及复发率高的急性缺血性脑血管病,占全部脑卒中的60%-80%。缺血可以导致大量神经细胞出现不可逆的变性坏死,导致严重的神经功能缺损症状。促进缺血区新生血管的形成增加新的侧枝循环,可通过改善局部脑血流供应,挽救缺血半暗带内濒临死亡的神经细胞,促进神经功能的恢复,这对脑梗死有重要的治疗作用。已有研究证明,脑缺血可诱导血管新生,而HIF-1-VEGF-NOTCH通路是缺血缺氧后调节血管新生的重要的信号通路。微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内源性单链小分子RNA,参与了生物体的生长发育、器官形成、细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程,与多种疾病密切相关。研究发现,miR-376b-5p在脑缺血后缺血区脑组织内表达降低,我们通过生物学软件分析发现HIF-1a与miR-376b-5p的序列存在配对关系,故我们推测miR-376b-5p可能参与了血管新生的调控过程,并且可能通过HIF-1-VEGF-Notch信号通路来调控血管新生。本研究通过体内外实验观察脑缺血缺氧后miR-376b-5p、HIF-1-VEGF-Notch信号分子的表达变化和血管新生情况,并通过体外实验观察过表达和抑制miR-376b-5p对内皮细胞血管新生能力及HIF-1-VEGF-Notch信号通路分子表达的影响,探讨miR-376b-5p对血管新生的调控作用及可能作用的信号途径,以期为脑梗死的治疗提供一种新策略。方法：1.体内实验1.1构建大鼠永久性局灶性大脑中动脉脑缺血(Permanentmiddlecerebralarteryocclusion,pMCAO)模型,于pMCAO后1天,3天,7天收集脑组织标本。1.2通过神经缺损评分和TTC染色方法鉴定建模是否成功。1.3通过免疫组化方法检测缺血脑皮质区第八因子相关抗原因子(vWF)的表达情况从而判断血管新生情况。1.4采用实时荧光定量PCR的方法检测缺血脑皮质区miR-376b-5p、HIF-1amRNA、VEGFAmRNA、NotchlmRNA的表达变化。1.5运用Westernblot的方法观察缺血脑皮质区HIF-1α、VEGFA、Notchl的蛋白表达变化。2.体外实验2.1建立了人脐静脉内皮细胞(HUVEC)缺氧模型。2.2运用MTT,Transwell和Matrigel基质胶实验比较常氧组和低氧组细胞的细胞增殖,细胞迁移以及小管形成情况,从而可以判断缺氧对血管新生的影响。运用实时荧光定量PCR和Westernblot的方法观察常氧组和低氧组中HIF-1α、VEGFA.Notchl在mRNA和蛋白水平的表达变化；运用实时荧光定量PCR的方法检测缺氧对细胞中miR-376b-5p表达的影响。2.3进一步通过在缺氧HUVEC细胞中转染miR-376b-5p模拟物或抑制物使miR-376b-5p过表达或者抑制表达,观察转染后内皮细胞血管新生的能力以及细胞中HIF-1α、VEGFA、Notchl在mRNA和蛋白水平的表达变化,从而明确miR-376b-5p对血管新生的调控作用。2.4为了进一步研究miR-376b-5p对血管新生的调控机制,我们构建了HIF-1ashRNA表达载体,将其转染入缺氧HUVEC细胞中以敲除HIF-1α的作用,通过比较HIF-1α被抑制前后,miR-376b-5p模拟物或抑制物对内皮细胞血管新生能力的影响以及细胞中HIF-1α、VEGFA、Notchl分子在mRNA和蛋白水平的表达变化,从而探讨miR-376b-5p是否通过HIF-1-VEGF-Notch信号通路影响血管新生。结果：1.体内实验1.1成功构建了大鼠永久性局灶性大脑中动脉脑缺血(pMCAO)模型,TTC染色显示：右侧大脑中动脉供血区的梗死区域呈白色,正常脑组织呈红色。1.2免疫组化结果显示：pMCAO1天,3天,7天组缺血脑组织第八因子相关抗原因子(vWF)表达水平与假手术组相比均上调,反映了pMCAO1天,3天,7天组缺血区中微血管密度比假手术组均增加,提示脑缺血损伤可导致反应性血管新生。1.3实时荧光定量PCR结果显示：pMCAO后1天,3天,7天组缺血脑皮质区miR-376b-5p的表达水平与假手术组相比均降低,并且HIF-1amRNA、VEGFAmRNA、NotchlmRNA的表达均增加。1.4Westernblot结果显示：pMCAO后1天,3天,7天组缺血脑皮质区HIF-1α、VEGFA、Notchl的蛋白表达与假手术组相比均增加。2.体外实验2.1缺氧组与常氧组相比,miR-376b-5p的表达水平降低,而HUVEC的细胞增殖,细胞迁移以及小管形成能力增强,即血管新生能力增强,同时HIF-1α、VEGFA、Notchl在mRNA水平和蛋白水平的表达也增加,提示miR-376b-5p可能对内皮细胞的血管新生具有抑制作用。2.2将miR-376b-5p模拟物转染缺氧细胞后,内皮细胞形成新生血管的能力减弱,同时HIF-1α、VEGFA、Notchl在mRNA水平和蛋白水平的表达也降低；而miR-376b-5p抑制物转染缺氧细胞后,内皮细胞形成新生血管的能力增强,同时HIF-1α、VEGFA、Notch1在mRNA水平和蛋白水平的表达也增加,初步明确了缺氧后miR-376b-5p可能通过HIF-1-VEGF-Notch信号通路调控了血管新生。2.3将HIF-1αshRNA表达载体转染入缺氧HUVEC细胞敲除HIF-1α的作用后,miR-376b-5p模拟物(或抑制物)与HIF-1αshRNA共转染组与单纯miR-376b-5p模拟物(或抑制物)转染组相比,内皮细胞形成新生血管的能力发生改变,同时HIF-1α、VEGFA、Notchl在mRNA水平和蛋白水平的表达也产生变化,进一步明确了miR-376b-5p是通过调控HIF-1-VEGF-Notch信号通路来发挥对血管新生的负调控作用。结论：1.miR-376b-5p对脑缺血缺氧后的血管新生具有抑制作用。2.miR-376b-5p可能是通过调控HIF-1-VEGF-Notch信号通路来参与抑制血管新生的过程。3.通过干预miR-376b-5p的表达,促进新生血管形成,为脑梗死的治疗提供了一种新思路。图32幅,表6个,参考文献101篇。
【作者】李灵娟；
【导师】刘运海；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】miR-376b-5p；血管新生；脑缺血；HIF-1-VEGF-Notch信号通路；

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