EphA2经P-gp及自噬作用调控鼻咽癌紫杉醇耐药性

【摘要】目的：鼻咽癌紫杉醇耐药性的形成是一复杂调控机制,鉴于经典耐药理论中P-gp蛋白发挥的重要作用以及近年来自噬作用在肿瘤化疗耐药领域的新兴热点地位,本研究在发现EphA2可对鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性起调控作用的前期研究基础上,旨在进一步探讨EphA2调控鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性的P-gp相关及自噬相关分子机制。方法：1.利用WesternBlot分别检测鼻咽癌细胞中慢病毒介导的EphA2沉默及过表达组与阴性对照组(转染无义shRNA或无义cDNA)和空白对照组(转染空载体)内P-gp蛋白的表达情况,探讨EphA2是否具有调控鼻咽癌细胞P-gp表达的能力；2.利用siRNA干扰技术在鼻咽癌细胞中下调P-gp的表达,同时给予空白对照组(原始细胞)、阴性对照组(转染无义序列)和P-gp表达下调组0.1nM/L的紫杉醇(该浓度为前期研究所得的原始细胞的IC30浓度,结合文献,考虑到P-gp表达下调后的紫杉醇增敏作用,故选择该浓度)刺激,48小时后CCK-8法检测吸光度,得到各组的存活率,以说明P-gp蛋白的表达改变是否影响鼻咽癌细胞的紫杉醇耐药行为；3.利用siRNA干扰技术在EphA2过表达鼻咽癌细胞中下调P-gp的表达,同时给予空白对照组(EphA2过表达细胞)、阴性对照组(EphA2过表达并转染无义序列细胞)和P-gp表达下调组(EphA2过表达并P-gp表达下调细胞)5nM/L的紫杉醇(前期研究基础中该浓度下实验组与对照组存活率差异最大)刺激,48小时后CCK-8法检测吸光度,得到各组的存活率,以探讨在EphA2过表达细胞中,调控P-gp表达对鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性的影响；4.鉴于文献报道PI3-K/Akt通路参与P-gp蛋白表达调控以及前期研究发现EphA2通过PI3-K/Akt通路影响鼻咽癌紫杉醇耐药性,本研究在EphA2过表达鼻咽癌细胞中,分别加入0nM/L和20nM/L的PI3-K/Akt抑制剂LY294002,再给予5nM/L的紫杉醇刺激,48小时后利用WesternBlot检测各组PI3-K/Akt信号通路蛋白Akt和p-Akt,以及P-gp的表达水平,以探讨在EphA2过表达细胞中,PI3-K/Akt通路是否参与P-gp蛋白的表达调控；5.给予实验组(EphA2过表达鼻咽癌细胞)及对照组(转染无义cDNA)5nM/L紫杉醇刺激,48小时后利用WesternBlot检测自噬标志性LC3B-Ⅱ蛋白在实验组及对照组中的表达差异,初步探讨EphA2调控鼻咽癌紫杉醇耐药性的可能机制(自噬作用)。结果：1.EphA2沉默组中P-gp蛋白较两对照组表达下调,EphA2过表达组中P-gp蛋白较两对照组表达上调；2.紫杉醇作用于空白对照组、阴性对照组和P-gp表达下调组的存活率分别是68.9±4.0%,72.4±6.2%v.s.52.1±3.7%,P-gp表达下调组对紫杉醇的耐药性较两对照组降低(P<0.05)；3.在EphA2过表达鼻咽癌细胞中,紫杉醇作用于空白对照组、阴性对照组和P-gp表达下调组的存活率分别是57.9±6.2%,58.2±5.8%v.s.36.1±5.1%,P-gp表达下调组对紫杉醇的耐药性较两对照组降低(P<0.05)；4.在EphA2过表达鼻咽癌细胞中,给予通路抑制剂组较对照组Akt表达基本不变,而磷酸化的Akt表达下降,P-gp表达下降；5.EphA2过表达鼻咽癌细胞株中自噬标志性LC3B-Ⅱ蛋白的表达较对照组显著上调。结论：1.EphA2具有调控鼻咽癌细胞P-gp表达的能力；2.下调P-gp蛋白表达可降低鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性；3.下调P-gp蛋白表达可逆转EphA2介导的鼻咽癌紫杉醇耐药性；4.在EphA2过表达细胞中,PI3-K/Akt通路参与P-gp蛋白的表达调控；5.在经紫杉醇作用的鼻咽癌细胞中,EphA2表达的改变能影响自噬相关蛋白的表达水平,提示EphA2也可能经白噬途径调控鼻咽癌细胞的紫杉醇耐药性。综上所述,EphA2可通过介导P-gp蛋白表达,进而调控鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性,PI3-K/Akt通路可能参与这一过程；此外,EphA2还可能经自噬途径调控鼻咽癌细胞紫杉醇耐药性。EphA2有望成为鼻咽癌紫杉醇增敏靶点。
【作者】王芸芸；
【导师】田勇泉；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】EphA2；鼻咽癌；化疗耐药性；P-gp；PI3-K/Akt；自噬作用；紫杉醇；

【参考文献】
[1]梁瑞格.唐代见危不救罪研究[D].郑州大学,法律史,2013,硕士.
[2]高健雄,孙丽,周石光.重钢2450mm中板轧机液压AGC系统[J].冶金自动化,2002,01:53-55.
[3]王永友.XX公司薪酬结构优化研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[4]张倓恺.直喷汽油单孔喷油器喷雾微观结构特性的研究[D].天津大学,动力工程,2013,硕士.
[5]詹楸毅.电子政务网络行为管理系统的设计与实现[D].华侨大学,计算机技术（专业学位）,2013,硕士.
[6]张健.论行政诉讼受案范围的立法完善[D].大连海事大学,法律,2012,硕士.
[7]张淑娟.基于数字家庭网关的身份认证平台的设计与实现[D].西安电子科技大学,计算机系统结构,2012,硕士.
[8]郑丽.5-氨基乙酰丙酸（ALA）延缓切花菊衰老的生理机理研究[D].南京农业大学,园林植物与观赏园艺,2013,硕士.
[9]金辉辉.项目管理的时间管理研究[D].浙江大学,2007.
[10]黄金光.几种林木病毒鉴定与林业微生物菌种数据库查询系统构建[D].中国农业大学,植物病理学,2004,硕士.
[11]李丽萍.校本课程开发对高中英语学习促进作用的研究[D].山东师范大学,学科教学（专业学位）,2013,硕士.
[12]范佳甲.伍德罗·威尔逊总统权力扩张思想研究[D].内蒙古师范大学,专门史,2013,硕士.
[13]李齐.光电成像测量伺服系统性能测试方法研究[D].哈尔滨工业大学,控制科学与工程,2014,硕士.
[14]程晓辉.DeviceNet现场总线在低压电器上的应用研究[D].东华大学,模式识别与智能系统,2004,硕士.
[15]陈奇.用数字说话——湖北移动实施分析型管理[J].通信企业管理,2004,02:46-47.
[16]宋佳.邢台市中学教师职业幸福感调查研究[D].河北大学,思想政治教育,2014,硕士.
[17]周燕平.社会网络中的市场运行与包容性增长[D].华中师范大学,社会学,2014,硕士.
[18]陈新卉.交互式电子白板技术在《圆锥曲线》教学中的应用研究[D].山东师范大学,教育（专业学位）,2013,硕士.
[19]邹乐君.基于光学遥感的海岛识别及算法研究[D].浙江大学,2010.
[20]王梅杰.高校德育生活化视阈中的大学生现代人格塑造探究[D].苏州大学,思想政治教育,2014,硕士.
[21]斯幸峰.片段化生境中繁殖鸟类群落的物种周转与β多样性[D].浙江大学,生态学,2014,博士.
[22]李江梅.晚唐乱离诗研究[D].沈阳师范大学,中国古代文学,2013,硕士.
[23]钱素琴.智能化服装款式设计系统的研究[D].东华大学,控制理论与控制工程,2004,硕士.
[24]吴燕.中药质量控制中的中药全息指纹图谱模式识别方法的研究及应用[D].中南民族大学,药物化学,2013,硕士.
[25]马巧灵.杜甫节令诗研究[D].山东大学,中国古代文学,2013,硕士.
[26]马建良.GPS技术在地铁控制网测量中的应用研究[D].中国地质大学（北京）,测绘工程,2013,硕士.
[27]陈方方.地下洞室弹塑性仿真反分析研究[D].西安理工大学,岩土工程,2004,硕士.
[28]张英英.聚乙二醇干扰素α-2a与普通干扰素α-2b联合利巴韦林抗丙肝病毒治疗的疗效比较及抗病毒疗效预测因素分析[D].郑州大学,内科学,2013,硕士.
[29]步蓬勃.走向幸福：人与自然的双重解放[D].东北师范大学,国外马克思主义研究,2014,博士.
[30]余英龙.基于用户体验的移动学习系统研究[D].西南大学,教育技术学,2014,硕士.
[31]于雷.我国个体经济市场监管存在的问题及对策研究[D].青岛大学,马克思主义中国化,2013,硕士.
[32]刘嘉.非常规突发事件应对决策行为研究[D].武汉理工大学,管理科学与工程,2012,硕士.
[33]吴炜.寒冷地区AC-16改性沥青生产配合比验证设计[D].吉林大学,交通运输工程,2012,硕士.
[34]吕婷.酶法提取鱼皮胶原蛋白活性短肽的研究[D].大连工业大学,发酵工程,2009,硕士.
[35]于欣.基于活动理论的英语学术写作课案例分析[D].北京外国语大学,英语语言文学,2014,硕士.
[36]唐莉.免疫抑制治疗重型再生障碍性贫血的临床研究[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[37]王建民.新型稀土镍基自熔性合金涂层高耐磨耐蚀性的研究[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[38]王晶.双横臂独立悬架系统的整车虚拟实验研究[D].河北工程大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[39]周琳.银基透明导电薄膜及其在有机太阳能电池中的应用[D].华东师范大学,纳米物理学,2013,硕士.
[40]王圆辉,刘菁.关于北京二七轨道交通装备有限责任公司企业发展的SWOT分析[J].中国管理信息化,2014,24:60-61.
[41]房凌灿子.地方政府环境政策执行研究[D].中国矿业大学,行政管理,2014,硕士.
[42]牛伟亮,李超,王磊,杜会卿,刘志刚.面向地铁车辆的辅助逆变系统设计[J].电子设计工程,2015,02:94-97.
[43]任宇.创始人更迭对会计稳健性的影响研究[D].安徽大学,会计学,2014,硕士.
[44]刘峰.威廉·霍华德·塔夫脱的政治和司法生涯研究[D].山东师范大学,世界史,2013,硕士.
[45]董士璇,刘玉明.基于系统动力学的绿色建筑规模化推进策略研究[J].工程管理学报,2013,06:16-20.
[46]陈亚梅,和润莲,邓长春,刘洋,杨万勤,张健.川西高山林线交错带凋落物纤维素分解酶活性研究[J].植物生态学报,2014,04:334-342.
[47]付明浩.Ti6Al4V表面Ni-P化学镀厚镀层的研究[D].沈阳理工大学,材料学,2013,硕士.
[48]蔡言厚,蔡莉.大学单指标评价排行促进大学向特色发展的实证考察[J].中国高等教育评估,2014,04:3-11.
[49]夏浩.工业级规格喷射成形7055铝合金的组织演变与力学性能[D].兰州理工大学,材料加工工程,2013,硕士.
[50]刘凤茹.麦胚蛋白聚集行为及其钙离子螯合肽的制备与评价[D].江南大学,粮食、油脂及植物蛋白工程,2014,博士.