巨噬细胞中Rheb1敲除对小鼠机体代谢的调节作用及机制探讨

【摘要】第一部分mTOR信号通路受抑制对巨噬细胞极化和炎症因子分泌的影响目的巨噬细胞在受到炎症信号、应激、代谢物等刺激下会向促炎性(M1型)或抗炎性(M2型)方向极化,并呈现不同水平的促炎性或抗炎性媒介分泌谱。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白/雷帕霉素机能靶蛋白(Mammalian/MechanisticTargetof雷帕霉素,mTOR)信号通路是生长、发育、代谢、免疫、癌症等生理活动的主要调控者,本研究旨在探讨雷帕霉素作用导致的mTOR信号通路改变对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)、棕榈酸(Palmiticacid,PA)及油酸(Oleicacid,OA)刺激下巨噬细胞的M1/M2极化趋势及相应的炎症介质分泌的影响。方法将Raw264.7小鼠巨噬细胞稳定株均匀铺板后,分成以下几组：①未干预组；②刺激物单独干预组；③mTOR信号通路抑制剂雷帕霉素干预组；④刺激物+雷帕霉素共同干预组。刺激物分别为LPS、PA和OA,选取最佳干预物浓度和作用时间进行干预试验,干预结束后收集细胞提取mRNA,通过qRT-PCR检测巨噬细胞募集、促炎及抗炎相关基因的表达。结果①在LPS诱导经典的促炎性模型中,与未干预组相比,LPS刺激显著提高促炎性因子IL-1β的水平,而雷帕霉素刺激也可促进IL-1β的表达,两者共同刺激时对基因的表达具有叠加效应。②与未干预组相比,PA单独刺激可显著提高IL-1β水平；雷帕霉素刺激可抑制巨噬细胞募集相关基因MCP-1的表达,同样两者共同刺激对于IL-1p表达的促进和MCP-1表达的抑制有叠加作用。③与未干预组相比,OA单独刺激可促进IL-1p及Mrc1表达；而加用雷帕霉素能显著抑制OA对MCP-1的正调控作用,同样对于IL-1p与Mrc1表达的促进有叠加作用。结论LPS、PA及OA都能够诱导巨噬细胞M1型极化,促进促炎因子的分泌；mTOR信号通路抑制也可诱导巨噬细胞M1型极化,促进促炎性因子分泌,促进部分抗炎性介质的分泌。第二部分巨噬细胞特异性敲除Rheb1蛋白对高脂诱导的肥胖小鼠整体代谢水平的影响目的建立巨噬细胞Rheb1敲除的小鼠模型,通过高脂喂养建立肥胖小鼠模型,研究巨噬细胞Rheb1敲除的小鼠对高脂诱导的肥胖及糖脂代谢的作用。方法构建并通过提取尾尖DNA电泳、分离原代巨噬细胞行qPCR及Western-Blot等方式鉴定Rheb1巨噬细胞敲除小鼠模型。将5-6周龄敲除小鼠(KO小鼠,实验组)与同窝野生型Rheb1flox/flox小鼠(WT小鼠,对照组)分别进行4个月高脂食物饲养(high-fatdiet,HFD)和普通食物喂养(normaldiet,ND)。实验结束后检测小鼠体重和食物消耗量,通过GTT及ITT检测小鼠葡萄糖耐受及胰岛素敏感性情况。通过大体和切片HE染色、油红O染色及免疫荧光等手段观察肝脏、脂肪及肌肉的形态学改变。结果①通过尾尖提取DNA经PCR扩增及琼脂糖电泳、提取原代巨噬细胞mRNA后行qRT-PCR以及提取蛋白行Western-Blot试验鉴定Rheb1flox/floxF4/80CreTg/0(KO)与Rheb1flox/flox(WT)两种基因型。②自第10周龄起,高脂组小鼠的平均体重明显高于正常喂养组,高脂组两组小鼠体重比较在第19及20周龄具有显著差异。③GTT结果示,高脂10周与同期正常喂养时WT与KO小鼠的葡萄糖耐量无统计学差异；而16周后两组小鼠的葡萄糖耐量有统计学差异,通过曲线下面积及各血糖监测时间点的比较得出KO组的葡萄糖耐量更差。④ITT结果示,高脂喂养10周时两组小鼠胰岛素敏感性无统计学差；,而在16周后,KO小鼠组的胰岛素敏感性远远优于WT小鼠。⑤高脂喂养5个月后,无论是空腹还是喂食状态下,KO组小鼠的肝脏较WT组体积明显偏小,重量明显减轻,且脂肪肝程度减轻,而同龄正常饮食下两组小鼠的肝脏重量无明显差别,油红O染色及HE染色一致表明KO组肝脏脂肪变性及受损程度减轻；同时,高脂喂养下KO组脂肪组织血管基质层有明显的炎症细胞。而高脂喂养下两组小鼠的肌肉组织无明显形态学差别。结论巨噬细胞Rheb1蛋白特异性敲除,可延缓肥胖的发展,在损害葡萄糖耐量的同时改善高脂喂养下周围血糖调节靶器官的胰岛素敏感性,减轻因长期高脂饮食诱发的胰岛素抵抗,该改善作用可能与延缓脂肪肝发展有关。第三部分巨噬细胞特异性敲除Rheb1蛋白对高脂诱导的脂肪肝的作用目的探讨巨噬细胞特异性敲除Rheb1蛋白后对高脂诱导的脂肪肝形成及发展的作用,以及对肝脏巨噬细胞浸润、促炎／抗炎炎症谱及糖脂代谢功能的影响。方法PTT检测高脂喂养下WT组与KO组小鼠肝脏糖异生功能的变化。获取禁食过夜的WT组与KO组小鼠肝脏组织,通过qRT-PCR法检测巨噬细胞浸润极化、促炎／抗炎炎症谱、糖脂代谢相关酶mRNA水平上的表达改变。结果①PTT结果示高脂喂养4个月后,两组小鼠的丙酮酸耐量整体有差异虽未达到统计学水平,较GTT两组血糖变化差异明显减小。②qRT-PCR结果示KO组小鼠巨噬细胞浸润指标、M2型抗炎症指标和大部分M1型促炎症指标基因表达较WT组表达降低；KO组小鼠肝脏中与肝糖原分解的G-6Pase、与脂质合成的ACC及SREBP1基因表达水平较WT组有显著下降。结论巨噬细胞Rheb1敲除后可改善高脂诱导肥胖相关的脂肪肝进展,可能与改善肝脏糖脂代谢调节功能、减少肝脏巨噬细胞浸润及促炎性介质的分泌有关。第四部分巨噬细胞特异性敲除Rheb1基因对脂肪组织的影响目的探讨巨噬细胞特异性敲除Rheb1蛋白后对高脂诱导的肥胖小鼠皮下脂肪、性腺脂肪、内脏脂肪及褐色脂肪中的巨噬细胞浸润、促炎／抗炎炎症谱及产热、褐色化功能的影响。方法获取高脂喂养WT组与KO组小鼠皮下脂肪、性腺脂肪、肠系膜间脂肪及褐色脂肪,通过qRT-PCR法检测巨噬细胞浸润、促炎／抗炎炎症谱、产热及褐色化功能mRNA水平上的改变。结果①qRT-PCR结果示高脂喂养时,KO组小鼠的皮下脂肪组织中大部分M1型炎症指标及部分M2型炎症指标表达水平较WT组降低；在性腺脂肪组织中,KO组的F4/80表达下降,各种M1型指标表达变化趋势不一,但绝大部分M2型指标基因表达水平上升；在褐色脂肪组织中主要表现为,KO组的F4/80表达水平显著提高,大多数M2型指标(IL-4,IL-10,Mrc1,Mg12),巨噬细胞浸润程度改变与性腺脂肪的截然相反,但同时具有向M2型极化的趋势；而在肠系膜脂肪组织中的巨噬细胞浸润程度及M1/M2型极化趋势在WT组与KO组中无统计学差异。②皮下脂肪及性腺脂肪组织中表达CD11c+CD206-标记物的细胞在KO组小鼠中表达减少,而表达CD11c-CD206+标记物的细胞比例稍增加,同时这两种细胞群的比值在KO组小鼠中同样是降低的趋势,尤其是在皮下脂肪组织内。③较WT组相比,KO组皮下脂肪组织中PAPRγ、Prdm16、UCP1表达有显著上升；在性腺脂肪中,除Prdm16外的其他产热及褐色化基因表达改变趋势同皮下组织；在褐色脂肪组织中,KO组所有待测基因的表达水平均显著高于WT组,尤其是PGC1α、Cidea、PAPRy、Prdm16和UCP1；肠系膜脂肪组织中仅PAPRy的表达改变有统计学意义(P<0.05),同时PAPRy还是M2型炎症的一个指标,余产热及褐色化功能相关基因改变不显著。结论巨噬细胞Rheb1敲除后,高脂喂养导致的皮下脂肪组织内所浸润的巨噬细胞M2型极化与脂肪产热及褐色化功能增强有正相关性,而褐色脂肪组织中巨噬细胞浸润增加以及M2型极化也与脂肪产热及褐色化功能增强有正相关性；性腺脂肪巨噬细胞浸润极化与脂肪产热及褐色化功能关系待进一步探讨,肠系膜间脂肪的产热及褐色化功能可能未受到巨噬细胞内Rheb1蛋白敲除的影响。
【作者】贺洁宇；
【导师】刘峰；胡芳；戴如春；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】Raw264.7；巨噬细胞；极化；mTOR；雷帕霉素；高脂饮食诱导肥胖；Rheb1flox/floxF4/80CreTg/0小鼠；Rheb1flox/flox小鼠；Rheb1；脂肪肝；巨噬细胞浸润；高脂饮食；Rheb1flox/floxF4/80CreTg/D小鼠；糖异生；脂质合成；脂肪组织；产热；褐色化；

【参考文献】
[1]周寻梦.基于NPAH理论的英、汉二语习得对比研究[D].青岛大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[2]于丹丹.我国信息技术系统在抗震减灾中的缺欠与完善[D].东北大学,科学技术哲学,2009,硕士.
[3]任杏杏.中药治疗黄体功能不全性不孕症的临床应用分析[D].黑龙江中医药大学,中医学（专业学位）,2013,硕士.
[4]孙即超.工程地质量化分区及岩土工程勘察信息管理系统的研制[D].河北工业大学,结构工程,2004,硕士.
[5]嵇志涛.我国开放式基金投资风格漂移及其对基金绩效的影响研究[D].江西财经大学,金融学,2013,硕士.
[6]张晶.消费文化视域下的法国装饰艺术运动时期女性服饰设计[D].北京印刷学院,设计艺术学,2013,硕士.
[7]郑莹.基于SOAP协议的义务兵基础信息跟踪系统平台设计与实现[D].电子科技大学,软件工程（专业学位）,2011,硕士.
[8]张宏生,沈可.基于数据仓库的科研信息系统研究初探[J].数理医药学杂志,2005,03:283-284.
[9]唐岚,束洪春,于继来.影响充裕度指标的元件排序方法[J].电力系统自动化,2010,03:12-16.
[10]孙小娟.六塔斜拉桥静力稳定性研究[D].西南交通大学,桥梁与隧道工程,2014,硕士.
[11]熊雯.利用水蚯蚓进行污泥减量化的实验研究[D].西南交通大学,环境工程,2013,硕士.
[12]刘微.基于交互系统理论的手机游戏产品设计研究[D].沈阳航空航天大学,设计艺术学,2013,硕士.
[13]加沙拉提·白斯汉.基于B/S模式的小学成绩管理系统设计与实现[D].厦门大学,软件工程,2014,硕士.
[14]熊催明.高一化学现行教材中化学反应原理内容设置的比较研究[D].首都师范大学,化学教育,2013,硕士.
[15]吴伟.网络多媒体教室纯软件模型的研究与实现[D].南京理工大学,计算机软件与理论,2013,硕士.
[16]王改珍.中学教师与准教师数学史知识现状的比较研究[D].东北师范大学,学科教学,2012,硕士.
[17]孙琳琳.基于社会保障的退休回沪知青社会融合研究[D].上海工程技术大学,社会保障,2012,硕士.
[18]张雪洁.基于XML的数据集成平台框架及关键技术研究[D].河海大学,计算机应用技术,2004,硕士.
[19]王博慧.改性多酸基碳材料的设计合成及结构表征[D].辽宁师范大学,2012.
[20]李伟红.隔代教育与亲子教育的衔接问题研究[D].广西师范大学,社会工作（专业学位）,2013,硕士.
[21]宋如意.基于黎曼流形上的优化方法求解稀疏PCA[D].复旦大学,计算数学,2012,硕士.
[22]王希欣.WiMAX网络中基于休眠窗口调整的节能算法[D].西安电子科技大学,通信与信息系统,2012,硕士.
[23]杜军特,李扬.参数自整定模糊PID控制方法及其在漆包机中的应用[J].广东工业大学学报,2014,02:58-63.
[24]方振宁.QF公司发展战略研究[D].北京交通大学,2014.
[25]周方方.基于供需风险平衡的制造商进货检验方案优化研究[D].山东大学,管理科学与工程,2013,硕士.
[26]董广杰.基于ARM的图像采集与处理研究[D].青岛理工大学,控制工程,2013,硕士.
[27]于金波.伪满皇宫博物院营销战略研究[D].吉林大学,工商管理,2014,硕士.
[28]王丛.启蒙与救亡的变奏[D].中国政法大学,政治学理论,2013,硕士.
[29]朝乐蒙.中蒙蔬菜贸易问题研究[D].内蒙古师范大学,区域经济学,2012,硕士.
[30]王树芬.广义区间系统的状态估计问题研究[D].黑龙江大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[31]LiuBei.The Civil Rights Movement’s Positive Effects on African Americans and the Plights Facing Them[D].西安外国语大学,英语语言文学,2013,硕士.
[32]郭芳.核心力量训练对大学生视觉诱发电位及事件相关电位的影响[D].山东师范大学,运动人体科学,2013,硕士.
[33]谢欣.从《顺天时报》看晚清京剧的生态[D].中国戏曲学院,戏剧戏曲学,2013,硕士.
[34]赖宁.重型肝炎预后单因素分析及预后评估系统研究[D].重庆医科大学,传染病学,2004,硕士.
[35]吕亮.普朗铜矿床裂隙—脉系统[D].中国地质大学（北京）,地质工程,2014,硕士.
[36]高丽君,解学军,张嗣瀛.相对阶n~*=3的鲁棒直接型模型参考自适应控制[J].控制与决策,2004,04:444-447.
[37]汪玉明.朱子法哲学思想研究[D].福建师范大学,马克思主义哲学,2013,硕士.
[38]陈沅然.TIMP-3基因对肝癌细胞增殖、凋亡及侵袭转移的影响[D].广州医科大学,内科学,2014,硕士.
[39]王炳文.中国煤炭产业集中度及政策研究[D].北京交通大学,2013.
[40]黄琛琛.猪胎盘组织候选印记基因表达谱分析及相关基因网络构建[D].西南大学,遗传学,2013,硕士.
[41]卞育蓉.介孔TiO_2薄膜的制备及其在甲醇催化燃烧中的研究[D].上海大学,分析化学,2013,硕士.
[42]周杨.IPv6动态主机地址配置的研究与实现[D].西安电子科技大学,电子与通信工程,2012,硕士.
[43]张宇.外商直接投资与我国贸易收支的关联性研究[D].安徽大学,国际贸易学,2013,硕士.
[44]石洪刚.基于压缩感知的脉冲超宽带测距研究[D].哈尔滨工业大学,电子与通信工程,2013,硕士.
[45]胡娜.碳关税对中国经济预期影响的均衡分析[D].东北师范大学,国际贸易学,2012,硕士.
[46]代瑞旗.共沉淀制备Ni-Co/CeO_2双金属催化剂及其乙醇水蒸气重整制氢性能研究[D].合肥工业大学,化学工程（专业学位）,2013,硕士.
[47]王子河.西部侏罗系聚煤区榆林谷地茆—大西沟剖面潜在突水溃沙沙层沉积规律研究[D].中国矿业大学,水文学及水资源,2014,硕士.
[48]李锡鹏.川中丘陵区典型农田和森林土壤温室气体排放特征及影响因素[D].西南交通大学,环境工程,2014,硕士.
[49]梅文枫.PCR产物快速构建重组杆状病毒的方法及相关功能蛋白的研究[D].浙江理工大学,生物化学与分子生物学,2014,硕士.
[50]何欢.江盈科诗论研究[D].北京大学,文艺学,2013,硕士.