肺气肿小鼠肺内CD31~-CD45~-Sca-1~+细胞数量和Shh通路变化及腺病毒感染对其的影响

【摘要】第一部分CSE腹腔注射肺气肿小鼠肺内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的变化目的：检测腹腔注射香烟烟雾提取物(CSE)所致肺气肿小鼠的肺组织内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的表达水平。方法：将40只BALB/c近交系雄性小鼠,按随机数字表法随机分为PBS组和CSE组,每组各20只。在第1、11、22天,PBS组腹腔注射PBS缓冲液(0.01M,PH7.2-7.4),CSE组腹腔注射CSE(0.3ml)。在第28天结束建模,处死小鼠。小动物肺功能仪测定肺功能,记录气道阻力(Raw)和动态肺顺应性(Cdyn)等。肺组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后测定平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)。采用酶消化法制备全肺组织单细胞悬液后,流式细胞术检测肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比。实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh信号通路的三个关键组分Shh、Ptch1和Gli1的nRNA和蛋白表达水平。免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达。采用SPSS18.0统计软件包进行数据分析,正态分布的各组计量资料以(x±s)表示,采用两独立样本t检验比较两组间均数,P<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)CSE组小鼠气道阻力(Raw)较PBS组增高[(0.48+0.28)cmH2O.mL-1.min-1vs.(0.24±0.14)cmH2O.mL-1.min-1,P<0.05],CSE组小鼠动态肺顺应性(Cdyn)较PBS组降低[(0.054±0.019)ml/cmH2Ovs.(0.074±0.030)ml/cmH2O,P<0.05]。(2)小鼠肺组织病理学定量分析：CSE组的平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)较PBS组均增高[(42.0±4.2)μmvs.(23.8±0.8)μm,38.2%±2.1%vs.10.7%±1.3%,均P<0.05]。(3)流式细胞术检测小鼠肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比：CSE组较PBS组降低(0.87%±0.16%vs.1.26%±0.18%,P<0.05)。(4)实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA水平：CSE组Shh、Ptch1和Gli1的mRNA相对表达量较PBS组有降低趋势,但差异均无统计学意义(0.11+0.02vs.0.38±0.15,0.85±0.28vs.1.06±0.34,1.01±0.16vs.1.21±0.14,均P>0.05)。(5)免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptchl和Gli1的蛋白水平：CSE组的Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较PBS组均显著降低(0.28±0.15vs.0.52±0.02,0.12±0.05vs.0.36±0.05,0.17±0.04vs.0.45±0.11,均P<0.05)。(6)免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达：a.分布：Shh、Ptch1和Glil在小鼠肺组织中主要表达于肺泡以上气道的上皮细胞,少量表达于肺泡上皮细胞,Shh和Ptch1亚细胞定位在细胞浆和细胞膜,Gli1在细胞浆和细胞核。Shh和Ptch1在PBS组和CSE组中呈弱着色或不着色。b.表达：CSE组Glil的光密度较PBS组显著降低(6455±2606vs.13866±6364,P<0.05),CSE组Shh和Ptchl的光密度较PBS有降低趋势,但差异无统计学意义(8426±3646vs.9730±3959,4129±2320vs.6442±3496,均P>0.05)。结论：(1)腹腔注射CSE成功建立肺气肿小鼠模型；(2)在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠中肺CD31-CD45-Sca-1+细胞水平下降；(3)在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠肺组织中Shh信号通路受到抑制。第二部分腺病毒急性感染对肺气肿小鼠肺内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路的影响目的：检测腺病毒急性感染对香烟烟雾提取物(CSE)腹腔注射肺气肿小鼠肺组织内CD31-CD45-Sca-1+细胞数量和Shh信号通路表达水平的影响方法：将60只BALB/c近交系雄性小鼠,按随机数字表法随机分为PBS组、CSE组和CSE+Adenovirus(腺病毒)组,每组各20只。在第1、11、22天,PBS组腹腔注射PBS缓冲液(0.01M,PH7.2-7.4),CSE组和CSE+Adenovirus组腹腔注射CSE(0.3ml),第15天,PBS组和CSE组气管内滴注PBS缓冲液(0.01M,PH7.2-7.4),CSE+Adenovirus组气管内滴注腺病毒(0.3m1,1010ifu/m1)。第28天结束建模,处死小鼠。小动物肺功能仪测定肺功能,记录气道阻力(Raw)和动态肺顺应性(Cdyn)等。肺组织病理切片苏木素-伊红(HE)染色后测定平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI),并对气道和血管炎症进行半定量评分。采用酶消化法制备全肺组织单细胞悬液后,流式细胞术检测肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比。实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA和蛋白表达水平.免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Gli1在小鼠肺组织的分布及表达。采用SPSS18.0统计软件包进行数据分析,正态分布的各组计量资料以(x±s)表示,三组间两两比较采用单因素方差分析(LSD-t法),P<0.05为差异有统计学意义。结果：(1)CSE组的Raw较PBS组增高[(0.48+0.28)cmH20.mL-1.min-1vs.(0.24±0.14)cmH2O.mL-1.min-1,P<0.05],CSE+Adenovirus组Raw也较PBS组增高[(0.49±0.24)cmH2O.mL-1.min-1vs.(0.24±0.14)cmH20.mL-1.min-1,P<0.05],CSE组的Cdyn较PBS组降低[(0.054±0.019)ml/cmH2Ovs.(0.074±0.030)ml/cmH20,P<0.05],CSE+Adenovirus组的Cdyn也较PBS组降低[(0.052±0.014)ml/cmH20VS.(0.074±0.030)ml/cmH20,P<0.05],但CSE+Adenovirus组的Raw和Cdyn与CSE组之间的差异无统计学意义[(0.49+0.24)cmH2O.mL-1.min-1vs.(0.48±0.28)cmH20.mL-1.min-1,(0.052±0.014)ml/cmH2Ovs.(0.054±0.019)ml/cmH20,均P>0.05].(2)小鼠肺组织病理学定量分析：CSE组的平均内衬间隔(MLI)和肺泡破坏指数(DI)较PBS组均增高[(42.0±4.2)μmvs.(23.8±0.8)μm,38.2%±2.1%vs.10.7%±1.3%,均P<0.05]；CSE+Adenovirus组的MLI和DI较PBS组均增高[(38.1±2.1)μmvs.(23.8±0.8)μm,39.1%±2.6%vs.10.7%±1.3%,均P<0.05]。但CSE+Adenovirus组的MLI和DI与CSE组之间的差异无统计学意义[(38.1±2.1)μmvs.(42.0±4.2)μm,39.1%±2.6%vs.38.2%±2.1%,均P>0.05]。(3)小鼠肺组织气道和血管炎症半定量分析：CSE组的气道炎症半定量评分与PBS组间无显著性差异(0.18+0.08vs.0.12+0.15,P>0.05),CSE+Adenovirus组气道炎症半定量评分较CSE组增高(1.81+0.30vs.0.18+0.08,P<0.05)。CSE组的血管炎症半定量评分与PBS组间无显著性差异(0.08+0.02vs.0.01±0.02,P>0.05),CSE+Adenovirus组血管炎症半定量评分较CSE组增高(2.28+0.38vs.0.08+0.02,P<0.05)。(4)流式细胞术检测小鼠肺CD31-CD45-Sca-1+细胞占全肺细胞百分比：CSE组肺CD31-CD45-Sca-1+细胞比例较PBS组降低(0.87%±0.16%vs.1.26%±O.18%,P<0.05),CSE+Adenovirus组肺CD31-CD45-Sca-1+细胞比例较CSE组显著升高(1.30%±0.34%vs.0.87%±0.16%,P<0.05)。(5)实时荧光定量PCR检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的mRNA水平：CSE组Shh、Ptch1和Gli1的mRNA相对表达量较PBS组有降低趋势,但差异均无统计学意义(0.11±0.02vs.0.38±0.15,0.85±0.28vs.1.06±0.34,1.01±.0.16vs.1.21±0.14,均P>0.05),CSE+Adenovirus组Shh和Gli1的mRNA相对表达量较CSE组均增局(1.10±0.48vs.0.11±0.02,1.40±0.34vs.1.01±0.36,均P<0.05),CSE+Adenovirus组Ptch1的mRNA相对表达量较CSE组有升高趋势,但差异无统计学意义(0.98+0.40vs.0.85+0.28,P>0.05)。(6)免疫印迹法检测小鼠肺组织Shh、Ptch1和Gli1的蛋白水平：CSE组的Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较PBS组均降低(0.28±0.15vs.0.52±0.02,0.12±0.05vs.0.36±0.05,0.17±0.04vs.0.45+0.11,均P<0.05),CSE+Adenovirus组Shh、Ptch1和Gli1的蛋白相对表达量较CSE组均增高(0.73±0.16vs.0.28±0.15,0.62±0.08vs.0.12±0.05,0.56±0.22vs.0.17±0.04,均P<0.05)。(7)免疫组织化学法检测Shh、Ptch1和Glil在小鼠肺组织的表达：CSE组Gli1的光密度较PBS组显著降低(6455+2606vs.13866±6364,P<0.05),CSE组Shh和Ptchl的光密度较PBS有降低趋势,但差异无统计学意义(8426±3646vs.9730±3959,4129±2320vs.6442±3496,均.P>0.05),CSE+Adenovirus组Shh、Ptch1和Gli1的光密度较CSE组均升高(17490±7989vs.8426±3646,17347±7482vs.4129±2320,34418±7299vs.6455±2606,均P<0.05)。结论：在腹腔注射CSE所致肺气肿小鼠中：(1)腺病毒急性感染可上调受抑的肺CD31-CD45-Sca-1+细胞；(2)腺病毒急性感染可显著激活肺组织内Shh信号通路。
【作者】邓敏华；
【导师】陈平；陈燕；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】肺气肿；干细胞；肺CD31~-CD45~-Sca-1~+细胞；Shh信号通路；腺病毒；

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