痹肿消汤及其有效成分阿魏酸干预胶原诱导性关节炎大鼠的定量蛋白质组学研究

【摘要】背景和目的：类风湿关节炎(RheumatiodArthritisRA)是一种慢性自身免疫性疾病,病情复杂、缠绵、致残率高。由于发病机制尚不明确,致使迄今尚无理想的根治药物,西药治疗以缓解症状为主,其单靶点的治疗理念在对抗复杂病理机理的时候显得捉襟见肘。中医药治疗RA历史悠久,积累了丰富的临床经验,具有多靶点、多环节干预的优势。痹肿消汤是导师梁清华教授根据其多年临床经验总结的中药复方,对类风湿关节炎患者有较好的疗效。由于RA的病理机制尚不明确,同时我们也不完全清楚痹肿消汤的作用机制,这直接制约了此复方在临床中的进一步运用。因此,在本次研究中,我们拟通过定量蛋白质组学方法,在前期研究工作的基础上进一步探讨RA的病理机制及痹肿消汤治疗RA的作用机理,并阐明其作用的靶点及干预的信号通路,本研究有助于全面系统的阐明活动期RA发生发展的机制及痹肿消汤治疗活动期RA的疗效分子机理,为临床上治疗活动期RA寻找新的生物效应靶标奠定基础,为该方治疗活动期RA提供新的实验依据。方法：1.UPLC-PDA法对白花蛇舌草汤剂中活性成分的定量分析及大鼠灌胃白花蛇舌草汤剂后血清中可吸收成分的定性分析中药的有效成分复杂,从其化学成分入手是以现代化手段研究中药复方的方法之一。痹肿消汤由多味中药组成,白花蛇舌草在此方中是君药。由于白花蛇舌草有抗炎、抗氧化、调节免疫反应等作用,作为君药,其对抗RA的作用在此方中具有代表性,因此,我们选择了痹肿消汤中的君药白花蛇舌草作为研究对象来初步了解痹肿消汤发挥治疗作用的物质基础。这里,我们通过超高效液相色谱-光电二极管阵列(UPLC-PDA)法测定白花蛇舌草汤剂中活性成分含量；并同时测定活性成分的标准品,绘制标准曲线,对其精密度、回收率、样本稳定性和重复性进行验证。对正常SD大鼠灌胃白花蛇舌草汤剂30min后取血,运用UPLC-PDA法对大鼠血清中可吸收的活性成分进行定性检测。2.痹肿消及其活性成分阿魏酸在干预CIA的过程中的抗炎作用研究以不同剂量的阿魏酸标准品溶液干预CIA大鼠,用酶联免疫吸附剂测定法(ELISA)检测血清炎性细胞因子IL-1β、TNF-α的含量,得出剂量反应曲线,从而筛选出阿魏酸干预CIA大鼠的最佳剂量。以牛II型胶原蛋白混合完全弗氏佐剂全身多点注射于SD大鼠,复制出胶原诱导性关节炎(CIA)模型。以痹肿消汤剂和最佳剂量的阿魏酸干预CIA大鼠,动态观察一般情况、体重增长数、关节炎指数积分、关节肿胀度、关节X线摄片及关节滑膜组织病理学改变,并用ELISA同步检测各组大鼠血清IL-1β、TNF-α水平。3.痹肿消汤及其活性成分阿魏酸干预胶原诱导性关节炎的定量蛋白质组学研究分别提取各组大鼠在28天、42天的滑膜组织,抽提总蛋白,以iTRAQ试剂对不同组的蛋白进行标记,混合,经过SCX/RPLC分离,LC-MS/MS鉴定并筛选出各组差异表达的蛋白；通过IngenuityPathwayAnalysis(IPA)软件分析这些差异蛋白的生物信息,绘制出信号网络通路,寻找网络中与RA发生发展密切相关的关键性节点及通路；根据这些信息阐明RA发生发展的病理机制,并在此基础上进一步探讨痹肿消汤及其活性成分阿魏酸的作用机理。结果：1.UPLC-PDA法对白花蛇舌草汤剂中活性成分的定量分析及大鼠灌胃白花蛇舌草汤剂后血清中可吸收成分的定性分析通过UPLC-PDA法,在第8.33、10.61min时,白花蛇舌草汤剂中的活性成分对香豆酸、阿魏酸在色谱图中获得良好分离,最大吸收波长分别为308、321nm。两种成分在其检测范围内显示出良好的线性回归,R2>0.9998、0.9994,其标准品的日内、日间精密度良好,其相对标准差(RSD)波动在1.03-3.35%之间；对香豆酸、阿魏酸在白花蛇舌草汤剂中的稳定性、重复性良好,RSD波动在1.53-2.41%；同时这两种成分在汤剂中的加样回收率良好,平均加样回收率在97.9%-102.8%之间,RSD波动在1.26-2.41%；经UPLC-PDA法检测后,白花蛇舌草中对香豆酸、阿魏酸的得率为0.527、0.231mg(有效成分)/g(生药)。通过UPLC-PDA法,在第8.31、10.46min时,活性成分对香豆酸、阿魏酸在大鼠灌胃白花蛇舌草汤剂后血清中获得良好分离,最大吸收波长分别为308、321。通过研究对香豆酸、阿魏酸主要色谱峰的特征,SD健康大鼠灌胃白花蛇舌草汤剂30min后,这两种成分在血清中被成功检测出。2.痹肿消及其活性成分阿魏酸在干预CIA的过程中的抗炎作用研究通过不同干预剂量实验研究发现,剂量3组(1.28mg/kg-d)的阿魏酸在下调CIA大鼠血清IL-1β、TNF-α水平的效果较好,是本实验中阿魏酸以其抗炎作用干预CIA大鼠的最佳剂量。采用牛II型胶原蛋白混合完全弗氏佐剂多点注射SD大鼠的方法,成功复制CIA动物模型。在第14天对模型进行评估,成功率达96%。用上述最佳剂量干预CIA大鼠后：正常组大鼠活泼好动,进食正常；相对于正常大鼠,第14天后,模型组大鼠出现了精神萎靡、少动嗜睡、行动迟缓,饮食减少、关节红肿等症状,到第28天后,CIA大鼠体重增长比正常大鼠明显降低,部分大鼠出现关节肿胀变形、压痛明显、活动障碍,甚至双下肢僵硬瘫痪；相对于模型组大鼠,到第42天时,干预组大鼠行动较活泼,饮食改变不明显,关节炎指数、足爪肿胀较模型大鼠明显改善(P<0.05),平均体重较模型组大鼠略有上升。另外,通过病理学观察显示,与正常大鼠相比,CIA大鼠踝关节组织中可见大量的炎性细胞浸润；干预组随着时间推移炎症较前逐渐减轻,炎性细胞浸润程度较前减轻。通过X线摄片发现,与正常组大鼠相比,CIA大鼠踝关节周围可见明显肿胀的软组织,部分钙化,关节间隙模糊、狭窄,甚至消失；干预组大鼠关节周围软组织肿胀程度较模型组降低,关节问隙狭窄程度较模型组有所改善,但较正常组仍旧狭窄。利用ELISA检测各组大鼠在第28、42天血清中IL-1β、TNF-α水平发现模型组炎症因子水平较正常组明显上升(P<0.05)；而在干预组中,IL-1β、TNF-α平均水平较模型组有所下降(P<0.05)。3.痹肿消汤及其活性成分阿魏酸干预胶原诱导性关节炎的定量蛋白质组学研究通过质谱鉴定分析,与正常对照组相比,模型组28d与42d滑膜的共同差异表达蛋白为145个,其中,54个蛋白在模型28天与模型42天均较正常组下调,89个蛋白在模型28d与模型42d均较正常组上调。通过IPA软件分析发现,这些蛋白共在77个方面发挥着各自的功能,其中与RA相关的是：在疾病与紊态方面,参与较多的是结缔组织疾病、炎性疾病；在分子与细胞功能方面,参与较多的是细胞集结与组建、细胞间信号交互；在生理系统发育和功能方面,参与较多的是器官发育等。这些蛋白共参与了急性期反应、白介素4,7,12传导与生成、上皮细胞黏附等109条信号通路；根据这些差异蛋白及信号通路,软件共绘制出了细胞集结和运行网络、免疫细胞运动及追踪网络、脂质代谢与分子传输网络、骨骼和肌肉紊态网络、细胞集结和炎性反应网络、结缔组织发育和功能紊态共6个网络信息图,通过观察我们发现,MMP-3、APOE、LIFR、MFGE8、SERBP1等多个蛋白在图中处于中心位置,为连接信号通路的关键性节点,其异常表达导致相关信号通路与信号网络变化可能是RA的病理机制之一,有可能成为RA潜在的治疗靶点。经阿魏酸干预后,通过质谱鉴定分析,与模型组相比,阿魏酸干预组在第28天能调节47个异常表达的蛋白,第42天能调节37个异常表达的蛋白；在第28、42天均能对10个蛋白逆转其表达,其中6个蛋白表达下调,4个蛋白表达上调；微管蛋白α-1链、40S核糖体蛋白S9、细胞核增殖抗原这3个蛋白在28天和42天均与正常组表达无差异；通过IPA软件分析发现：阿魏酸干预后发生改变的所有差异蛋白共参与了AcutePhaseResponseSignaling等22条可能与类风湿性关节炎相关信号通路；根据这些差异蛋白及信号通路,共获得4个网络信息图,分别是：细胞集结与炎性反应网络、结缔组织紊乱与炎性疾病网络、细胞凋亡与存活网络、细胞间信号交互网络。通过观察我们发现,MFGE8在图中是连接信号通路的关键性节点；阿魏酸可能通过下调MFGE8等蛋白的表达来调控AcutePhaseResponseSignaling等信号通路,这可能是阿魏酸汤治疗RA的作用机制。经痹肿消汤干预后,通过质谱鉴定分析,与模型组相比,痹肿消干预组在第28天能调节152个异常表达的蛋白,第42天能调节207个异常表达的蛋白；在第28、42天均能对10个蛋白逆转其表达,其中7个蛋白表达下调,3个蛋白表达上调；α-1肌动蛋白、微管蛋白αα-1链、肌凝蛋白轻链1/3、肌钙蛋白2、肌凝蛋白4这5个蛋白在28d和42d均与正常组表达无差异；通过IPA软件分析发现：痹肿消干预后发生改变的所有蛋白共参与了ActinCytoskeletonSignaling等57条可能与类风湿性关节炎相关信号通路；根据这些差异蛋白及信号通路,共获得6个网络信息图,分别是：免疫细胞运动及追踪网络、细胞集结与炎性反应网络、结缔组织发育和功能紊态、结缔组织紊乱与炎性疾病网络、细胞功能与运行网络、细胞间信号交互网络。通过观察我们发现,MFGE8、SERBP1在图中是连接信号通路的关键性节点；痹肿消汤可能通过下调MFGE8、SERBP1等表达来调控ActinCytoskeletonSignaling等信号通路,这可能是痹肿消汤治疗RA的作用机制结论：1.通过UPLC-PDA法证实对香豆酸、阿魏酸是白花蛇舌草汤剂中的活性成分,并且是大鼠血清可吸收的成分。2.痹肿消汤及其活性成分阿魏酸能够下调CIA大鼠血清中I-1p和TNF-αα水平的作用,缓解胶原诱导性关节炎大鼠的炎症反应及关节炎症状,提示阿魏酸可能是痹肿消对抗类风湿性关节炎的物质基础之一。3.RA的发病机制与多个蛋白的异常表达及参与的多条信号通路相关,这些信号通路相互作用,形成了复杂的信号转导网络。在整个网络中,多个关键性蛋白的异常表达以及多个信号通路的异常变化,使得整个信号转导网络异常,这可能是RA的发病机制之一；痹肿消汤及其有效成分阿魏酸能够调节多个异常表达的蛋白,并可能通过调节这些关键蛋白及其相关的信号通路来干预整个信号转导网络,这可能是其治疗RA的作用机制。
【作者】祝皓；
【导师】梁清华；
【作者基本信息】中南大学，中西医结合，2014，博士
【关键词】超高效液相色谱；阿魏酸；类风湿性关节炎；定量蛋白质组学；iTRAQ；信号通路网络；IL-1β；TNF-α；

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