冠心Ⅱ号主要吸收成分羟基红花黄色素A抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度研究

【摘要】目的：动脉粥样硬化(atherosclerosis,As)是脂质代谢异常导致的动脉血管壁的慢性炎症性疾病,是冠心病、心肌梗死、高血压等心血管疾病共同的病理基础。冠心II号由已故的著名中医学家郭士魁先生所创制,方含丹参、川芎、赤芍、红花和降香五味中药(比例2：1：1：1：1),是治疗冠心病的经验方。中医方剂的疗效作用是中药中多种化学成分共同作用的结果。本实验目的：①运用超高效液相色谱(UPLC)法测定冠心Ⅱ号中有效成分的含量,定量分析阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种成分；②建立超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS、MS)法定量定性分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆中3种主要吸收成分阿魏酸、羟基红花黄色素A和丹参素；③选用ApoE-/-小鼠并给予高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型,从氧化应激机制角度,研究冠心Ⅱ号主要吸收成分羟基红花黄色素A抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度。方法：①超高效液相色谱(UPLC)法测定冠心Ⅱ号中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种有效成分的含量。色谱条件：流动相：甲醇(A)和1%乙酸水(B)；梯度洗脱：Omin97%B:1min97%B；6min85%B；11min80%B；15min55%B。②超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法对C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆主要吸收成分的定性定量分析。色谱条件：流动相：甲醇(A)-O.1%甲酸(B)；梯度洗脱：Omin90%B；5min40%B；6min10%B；7min10%B；8min90%B.质谱条件：离子源：ESI((电喷雾电离,electrosprayionization)；检测方式：正离子模式；扫描方式：MRM(多反应监测,multiple-reaetionmonitoring)；定量分析时的离子反应分别为m/z192.8-m/z133.96(阿魏酸)、m/z611-m/z491.04(羟基红花黄色素A)和m/z196.8-m/z178.96(丹参素)。③选定主要吸收成分羟基红花黄色素A,与母方冠心Ⅱ号对ApoE-/-小鼠抗动脉粥样硬化的疗效进行比较并明确机理,运用公式(相对贡献度=成分疗效÷母方疗效×100%),初步定量主要吸收成分羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号抗动脉粥样硬化的相对贡献度。在本课题研究中,以As模型组为参照,成分疗效是指与As模型组比较,给予羟基红花黄色素A干预后,各种药效指标含量或表达水平上升或下降的变化差值；母方疗效是指与As模型组比较,给予冠心Ⅱ号干预后,各种药效指标含量或表达水平上升或下降的变化差值,二者变化差值的比值即为羟基红花黄色素A的相对贡献度。选用ApoE-/-小鼠给予高脂饮食喂养8周建立动脉粥样硬化模型,行血脂[甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)]水平检测、主动脉弓HE染色和油红O染色以及血清丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽(GSH)、过氧化氢酶(CAT)含量测定；RealTimeQ-PCR检测胸腹主动脉肿瘤坏死因子-α[(TNF-α)、血管细胞黏附因子-1(VCAM-1)、白介素-1β(IL-1β)mRNA水平；WesternBlot检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1、IL-1β表达。结果：①UPLC法测定冠心Ⅱ号汤剂中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、原儿茶醛和芍药苷5种有效成分的含量。15min内5种成分良好分离,色谱峰单一且无杂峰干扰。线性回归、精确度、准确度、回收率、重现性和样本稳定性均良好。5种有效成分含量分别为：阿魏酸128.84+0.47(ng/mg·生药)、羟基红花黄色素A1949.61±1.56(ng/mg·生药)、丹参素270.38±1.95(ng/mg·生药)、原儿茶醛184.84±0.80(ng/mg·生药)、芍药苷389.67±0.91(ng/mg·生药)。②UPLC-MS/MS法对C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆3种主要吸收成分的定量定性分析,结果提示阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素均可在血浆中检测到,含量分别为：20.4ng/ml.154.Ong/ml和6.9ng/ml,其中羟基红花黄色素A含量最高。③选用ApoE-/-小鼠予以高脂饮食饲养建立动脉粥样硬化模型,结果提示：a)).血清血脂水平检测：与正常对照组相比,模型组TC、HDL-C、LDL-C水平增高,但TG没有差异。冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后TC、HDL-C、LDL-C水平下降,其中羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低血脂TC、HDL-C、LDL-C水平的相对贡献度分别为：46.42%、64.09%、53.89%；b).HE染色镜下可见动脉粥样斑块形成,油红O染色可见脂质及斑块呈红色。斑块面积分析,模型组为(43.25+3.70)%,冠心Ⅱ号组为(30.20+1.48)%,羟基红花黄色素A组为(35.63+2.06)%。羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号减少斑块面积的相对贡献度为58.39%；c).血清MDA、SOD、GSH、CAT含量测定：与正常对照组相比,模型组MDA含量增加,SCD、GSH、CAT水平下降；冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后MDA含量减少；SOD、GSB、CAT水平升高。羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低MDA含量和升高CAT、SOD、GSH水平的相对贡献度分别为：55.79%、56.00%、32.61%、28.34%;d).RealTimeQ-PCR检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA水平：与正常对照组相比,模型组TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA表达水平升高；冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后TNF-a.VCAM-1和IL-1βmRNA表达水平下降；羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低TNF-α、VCAM-1和IL-1βmRNA表达水平的相对贡献度分别为：81.83%、85.96%和82.67%；e).WesternBlot检测胸腹主动脉TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达：与正常对照组相比,模型组TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达升高；冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A干预后TNF-α、VCAM-1和IL-1p表达下降；羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号降低TNF-α、VCAM-1和IL-1β表达的相对贡献度分别为：58.88%、61.83%和52.17%。结论：①运用超高效液相色谱(UPLC)方法对冠心Ⅱ号汤剂中阿魏酸、羟基红花黄色素A、丹参素、芍药苷和原儿茶醛5种有效成分的含量测定,该方法快速灵敏、准确可靠、稳定且重复性好。②采用超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)法定性定量分析C57BL/6J小鼠灌胃冠心Ⅱ号血浆中3种主要吸收成分为阿魏酸、羟基红花黄色素A和丹参素,其中羟基红花黄色素A含量最高。为研究羟基红花黄色素A对冠心Ⅱ号抗动脉粥样硬化的机理及相对贡献度奠定了基础。③ApoE-/-小鼠经过高脂饮食喂养8周后,形成了典型的冠状动脉粥样硬化病变。冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A灌胃后,可以改善As病变小鼠血脂水平及斑块进展程度。④As病变小鼠机体氧化应激状态增强,冠心Ⅱ号和羟基红花黄色素A具有降低氧化应激水平从而减轻As病变程度的作用。⑤主要吸收成分羟基红花黄色素A和母方冠心Ⅱ号通过抗氧化应激发挥抗As作用,比较二者疗效,可认为羟基红花黄色素A在冠心Ⅱ号抗As过程中发挥了一定的相对贡献度。
【作者】王煜；
【导师】陈泽奇；黄熙；
【作者基本信息】中南大学，中西医结合临床，2014，博士
【关键词】动脉粥样硬化；冠心Ⅱ号；羟基红花黄色素A；ApoE-/-小鼠；氧化应激；

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