mTOR通路参与柯萨奇病毒B3诱导的HeLa细胞凋亡机制研究

【摘要】目的：分别通过mTOR和P13K抑制剂干预以及基因转染技术建立mTOR及相关通路抑制和其下游分子过表达后CVB3感染HeLa细胞模型,观察CVB3诱导产生细胞病变效应(CPE)和凋亡情况及CVB3复制、凋亡相关分子的变化,以探讨PI3K/Akt/mTOR信号通路在CVB3感染后导致的细胞凋亡中的作用。方法：首先,选用人宫颈癌细胞株(HeLa)建立经典CVB3感染细胞模型,分别用]mTOR抑制剂—雷帕霉素及P13K抑制剂—LY294002对模型进行干预,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,半定量PCR,WesternBlot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表达变化；其次,通过细胞稳定转染技术分别构建4EBP1、p70S6K、Aktl和Akt2过表达HeLa细胞系,建立CVB3感染细胞模型,采用流式细胞仪技术检测细胞凋亡率,Real-timePCR和WesternBlot检测细胞凋亡因子Bim、Bax、Caspase-9、Caspase-3及CVB3表达变化,免疫荧光及细胞电镜技术检测病毒复制情况。最后应用SPSS16.0统计软件对数据进行统计分析,P<0.05为差别具有统计学意义。结果：(1)雷帕霉素、LY294002均可抑制HeLa细胞活性,并呈浓度依赖效应；(2)雷帕霉素、LY294002对CVB3复制的作用不同但均可促进CVB3诱导的细胞凋亡；(3)雷帕霉素和LY294002可阻断CVB3对Bim活性的抑制作用,进一步促进CVB3诱导的Bax活化；(4)雷帕霉素和LY294002促进CVB3诱导的Caspase-9活化,同时促进Caspase-3的自我裂解,以启动Caspase级联反应；(5)空质粒过表达细胞株建立后,以正常HeLa细胞作为对照组进行WesternBloting验证,pcDNA3.1-myc-HisA(-)质粒转染组可见myc标签蛋白的表达；(6)不同基因过表达细胞株建立后,提取细胞总蛋白,以正常HeLa细胞及稳定表达空质粒HeLa细胞为对照组进行WesternBloting验证,可见质粒转染组分别可见4EBP1、p70S6K、Aktl和转基因Akt2表达明显增高；(7)过表达4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2可促进CVB3诱导的细胞凋亡和细胞病变效应；(8)过表达p70S6K、Aktl或Akt2可促进CVB3mRNA合成而抑制VP1表达,过表达4EBP1则抑制CVB3mRNA合成而促进VP1表达；(9)CVB3诱导的Bim和Bax的表达可被过表达4EBP1、p70S6K抑制,同时可被过表达Akt进一步活化；(10)CVB3诱导的Procaspase-9、Caspase-3自我裂解可被过表达4EBP1、p70S6K激活,同时被被过表达Aktl、Akt2阻断。结论：(1)mTORC1和P13K被分别抑制后在CVB3诱导的细胞凋亡过程中其调节机制可能不同：P13K抑制剂LY294002通过上调CVB3mRNA和Bim、Bax、Caspase-9和Caspase-3的活性来促进CVB3诱导的细胞凋亡。而与此不同的是,mTOR抑制剂雷帕霉素在调节凋亡分子表达的同时通过上调CVB3衣壳蛋白VP1而非mRNA的表达来促进细胞凋亡。(2)成功构建真核表达载体pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2.(3)应用脂质体成功对各真核表达载体进行了细胞转染,并成功构建稳定过表达pcDNA3.1-myc-HisA(-)及pcDNA3.1-myc-HisA(-)-4EBP1/p70S6K/Akt1/Akt2的HeLa细胞株。(4)过表达4EBP1、p70S6K、Aktl或Akt2通过不同的机制促进CVB3诱导的HeLa细胞凋亡：过表达4EBP1、p70S6K通过一条不依赖Bim和Bax的凋亡途径促进细胞细胞凋亡,同时过表达4EBP1还可促进病毒的复制；相反,过表达Akt1、Akt2促进细胞凋亡则是通过一条不依赖Caspase家族的凋亡途径。
【作者】李欣；
【导师】杨作成；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】mTOR；信号通路；柯萨奇病毒B3；细胞凋亡；

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