miR-33a通过TWIST/ET-1信号级联通路调控骨肉瘤耐药的分子机制研究

【摘要】第一部分TWIST过表达及干扰稳定细胞系的构建目的：针对不同骨肉瘤细胞中TWIST的表达水平差异,分别构建稳定高表达TWIST基因和稳定干扰TWIST基因的骨肉瘤细胞系,用于后续的功能研究。方法：采用基因克隆构建TWIST真核表达载体pCDNA3.1(+)-TWIST,转染骨肉瘤细胞Saos-2细胞,G418筛选稳定表达细胞系,Westernblot检测获得TWIST稳定高表达细胞系Saos-2-TWIST细胞；采用TWISTshRNA慢病毒感染骨肉瘤MG63细胞,嘌呤霉素筛选,Westernblot检测获得稳定干扰TWIST的细胞系MG63-TWIST-shRNA。结果：分别采用限制性酶切分析、测序鉴定证实,成功构建了重组表达载体pCDNA3.1(+)-TWIST。分别经G418和嘌呤霉素筛选的细胞系,采用Westernblot检测,Saos-2-TWIST细胞可稳定高表达TWIST,而MG63-TWIST-shRNA中有效抑制TWIST的表达,干扰率80%以上。结论：成功构建TWIST稳定高表达和稳定干扰细胞系,并经Westernblot鉴定符合预期要求。图9幅,参考文献7篇。第二部分TWIST与ET-1及ETAR受体信号的相互作用对顺铂作用下的骨肉瘤细胞生存率的影响研究目的：探讨TWIST和ET-1/ETAR信号的相互作用对于骨肉瘤顺铂耐药性的影响及可能的作用机制。方法：1.分别采用RealtimePCR、Westernblot、ELISA检测不同TWIST表达水平的骨肉瘤细胞中ET-1的表达情况,并检测P13K抑制剂LY294002对TWIST和ET-1表达的影响；2.Tunel检测TWIST稳定高表达和干扰细胞系在采用PI3K抑制剂LY294002和ETAR抑制剂BQ123处理后细胞对顺铂的凋亡率变化；Westernblot检测骨肉瘤细胞在P13K抑制剂LY294002处理后p-AKT的表达水平。结果：1.Saos-2细胞高表达TWIST导致ET-1mRNA和蛋白表达水平显著降低,而MG63细胞中抑制TWIST表达后ET-1的表达上调；此外,PI3K抑制剂LY294002可致使骨肉瘤细胞中ET-1表达显著下调；2.TUNEL检测发现,Saos-2细胞中高表达TWIST将导致细胞对顺铂的凋亡率显著增加,而这一趋势可通过外源添加ET-1(100pM)蛋白而被扭转；此外,选择性ETAR抑制剂BQ123可以完全阻断ET-1的反调作用,而LY2904002可部分阻断这个效果；另一方面,MG63细胞中下调TWIST蛋白的表达显著降低了细胞凋亡率,而这一效应可被BQ123或者LY294002所抑制；3.Westernblot检测结果显示,Saos-2细胞中高表达TWIST显著降低了磷酸化AKT(Ser473)的表达水平,而LY294002作用后,磷酸化AKT(Ser473)下降更为显著,而在MG63细胞中,下调TWIST后,磷酸化AKT(Ser473)的表达水平增加了至少2倍以上,而此变化可被LY294002的作用所阻断。结论：TWIST通过抑制PBK/Akt通路下调ET-1/ETAR信号,从而降低骨肉瘤细胞对顺铂的生存率,降低其耐药性。图6幅,参考文献15篇。第三部分miR-33a通过下调TWIST提高骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性目的：筛选骨肉瘤化疗耐药患者中差异表达的]miRNAs,重点确定调控TWIST表达和骨肉瘤化疗耐药的miRNA。方法：1.miRNA芯片筛选骨肉瘤化疗耐药组和反应良好组肿瘤样本间差异表达的miRNA;2.采用双荧光素酶筛选并验证靶向干扰TWIST基因的miRNA;3.采用RealtimePCR和Westernblot检测35例骨肉瘤化疗耐药患者和35例反应良好患者的骨肉瘤组织样本中miRNA-33a表达水平和TWIST的蛋白水平；4.骨肉瘤细胞Saso-2和MG63及其相应的TWIST稳定表达或干扰细胞系,分别转染miR-33a和抑制剂antagomir-33a,Westernblot检测TWIST表达水平,TUNEL检测骨肉瘤细胞顺铂的凋亡率变化。结果：1.运用miRNA芯片筛选骨肉瘤样本中的差异miRNA,结果显示,骨肉瘤化疗耐药组与对照组相比,有25个差异miRNA,其中6个miRNA表达上调,9个miRNA表达下调；2.采用靶基因预测软件TargetScan并结合miRNA芯片分析的结果,筛选出靶向TWIST基因12个候选的miRNA,双荧光素酶显示miR-33a可靶向干扰TWIST基因的表达；3.RealtimePCR和Westernblot检测结果相关性分析显示,骨肉瘤组织中miR-33a表达水平与TWIST蛋白水平呈现负相关(r=-0.627,p<0.001)。miR-33a与肿瘤坏死率负相关(r=-0.352,p<0.001),而TWIST蛋白水平与肿瘤坏死率呈正相关(r=0.562,p<0.001);4.Tunel结果显示,顺铂作用的Saos-2细胞中转染antagomir-33a抑制miR-33a表达后可显著增加细胞凋亡率,且高表达的Saos-2-TWIST细胞中转染antagomir-33a,其细胞凋亡率增长更为显著；而TWIST过表达导致的细胞凋亡率增高的作用,可被细胞中高表达miR-33a所逆转；MG63细胞中高表达miR-33a可显著降低顺铂诱导的细胞凋亡率,且在稳定干扰的MG63-TWIST-shRNA细胞上高表达miR33a,其细胞凋亡率下降更为显著；antagomir-33a抑制mir-33a表达后可显著增加顺铂诱导的细胞凋亡率,而干扰TWIST表达后这一现象可被逆转。结论：miR-33a通过下调TWIST增强骨肉瘤细胞对顺铂的耐药性,提示抑制miR-33a/TWIST信号可能是增强骨肉瘤新辅助化疗疗效一个潜在的新策略。图8幅,表3个,参考文献13篇。
【作者】周勇；
【导师】黄祖发；张朝跃；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】骨肉瘤；TWIST；TWISTshRNA慢病毒；Saos-2细胞；MG63细胞；磷脂酰肌醇3激酶PI3K；AKT；内皮素ET-1；内皮素受体ETAR；顺铂；耐药性；miRNA芯片；miR-33a；靶基因；双荧光素酶；

【参考文献】
[1]郭东超.复杂网络拓扑结构的鲁棒性与动力学过程研究[D].北京交通大学,信号与信息处理,2014,博士.
[2]赵政,刘吉强.移动互联网音视频类协议识别技术研究与实现[J].信息网络安全,2014,12:61-64.
[3]李新宇,张建良,苏步新,国宏伟,郭建.图像技术在炼铁系统中的应用现状及发展(待续)[J].冶金自动化,2015,01:9-12+28.
[4]贾雯靖.安全绩效测量指标体系建立及其适用性研究[D].中国地质大学（北京）,安全技术及工程,2014,硕士.
[5]崔延群.微波—水热法制备石墨烯量子点及其氨基功能化研究[D].哈尔滨理工大学,2015.
[6]刘书玲.基于位置随机性和需求定量化的最大覆盖问题研究[D].西安建筑科技大学,计算数学,2013,硕士.
[7]何双毅.面向天然气固态储运的甲烷水合物反应动力学特性研究[D].重庆大学,动力工程及工程热物理,2014,硕士.
[8]雒真.动画呈现方式与空间能力对多媒体学习的影响[D].华中师范大学,教育技术学,2014,硕士.
[9]周蕾.人力资本溢价与企业绩效研究[D].对外经济贸易大学,企业管理,2014,博士.
[10]王惠永.节能型日光温室建造要点[J].农村实用工程技术.1993(03)
[11]栾蓉.移动阅读终端项目的研究与应用[D].南京理工大学,计算机技术,2012,硕士.
[12]侯忠生,董航瑞,金尚泰.基于坐标补偿的自动泊车系统无模型自适应控制[J].自动化学报,2015,04:823-831.
[13]李爱凝.网络言论自由的法律规制研究[D].重庆大学,法学理论,2014,硕士.
[14]卫祖德,陈隽.江汉HK地区三维地震勘探的地质效果[J].石油地球物理勘探,1983,05:411-422+456.
[15]吴杨梅.城镇化视角下景郊型乡村旅游地发展模式研究[D].华侨大学,人文地理学,2014,硕士.
[16]罗小松.基于韦伯局部特征的道路消失点检测[D].重庆大学,计算机应用技术,2014,硕士.
[17]苑溦.考虑地震动和腐蚀抗力衰减的跨海桥梁抗震性能研究[D].哈尔滨工业大学,防灾减灾工程及防护工程,2013,硕士.
[18]黄曼.俄译汉中民族文化信息的传译问题[D].吉林大学,俄语语言文学,2004,硕士.
[19]于大永.嵌入式全矢动平衡仪振动采集系统研究[D].郑州大学,机械电子工程,2013,硕士.
[20]吉训明.码头护岸边坡稳定分析方法探讨及应用[D].华南理工大学,建筑与土木工程,2014,硕士.
[21]李清华.国有商业银行经营转型实证研究[D].山东大学,工业工程（专业学位）,2012,硕士.
[22]李东.空间站在轨飞行与操作虚拟仿真技术研究[D].沈阳理工大学,检测技术与自动化装置,2012,硕士.
[23]晋芳.陕西省农村垃圾处理设施选择评价研究[D].西安建筑科技大学,土木工程建造与管理,2013,硕士.
[24]黄倩.农村公路碾压混凝土路面收缩性能与合理锯缝研究[D].重庆交通大学,道路与铁道工程,2012,硕士.
[25]崔宝玉,刘峰,杨模荣.内部人控制下的农民专业合作社治理——现实图景、政府规制与制度选择[J].经济学家,2012,06:85-92.
[26]高鹏,王建全,周文平,邹宇.基于无功功率捕捉失步解列断面的理论研究[J].电力系统自动化,2005,05:15-20.
[27]李伟强.胰十二指肠切除术后胰瘘的回顾性分析研究[D].第四军医大学,外科学（专业学位）,2014,硕士.
[28]段超.外语教师反思性教学实践研究[D].山西财经大学,外国语言学及应用语言学,2013,硕士.
[29]王小军.过渡金属（氢）氧化物纳米材料可控合成及电化学性质研究[D].北京化工大学,2012.
[30]赵浛希.高端酒店预订和点菜服务平台移动端系统的设计与实现[D].山东大学,软件工程（专业学位）,2013,硕士.
[31]金应荣,敖进清,贺毅.从事大学生科普教学的体会[J].教育教学论坛,2015,13:194-195.
[32]张增修.攻击型受欺者的社会行为与认知缺陷的研究[D].华东师范大学,基础心理学,2002,硕士.
[33]苏娜.探究中国古代天文仪器设计中的哲学智慧[D].东北大学,科学技术哲学,2010,硕士.
[34]何传龙.工业炸药包装过程在线检测技术及应用研究[D].广东工业大学,控制理论与控制工程,2013,硕士.
[35]张剑飞.数据挖掘中决策树分类方法研究[J].长春师范学院学报,2005,02:96-98.
[36]韩学军,刘滨涛,陈永辉,金煜,张国通,刘浩.基于无线通信的高压断路器温度在线监测系统[J].电力系统自动化,2006,08:84-88.
[37]吴月芳.数字城市建设中的图书馆[J].现代情报,2005,12:217-218+202.
[38]蒋涛,孙红辉,周友杰,李艾华.数据挖掘在柴油机故障诊断中的应用[J].机械,2004,07:53-55.
[39]刘宏茂,许再富,陈爱国.西双版纳土地的不同管理方式对植物多样性的影响评价探讨[J].植物生态学报,1998,06:39-43.
[40]李传霞.广州市四大公园观赏植物造景的初步研究[D].中南林学院,植物学,2004,硕士.
[41]毕立群.教化之道：《论语》的礼乐思想研究[D].上海大学,马克思主义哲学,2014,硕士.
[42]刘杨.增压柴油机进排气系统优化匹配的仿真研究[D].北京交通大学,2009.
[43]郑军.完善我国证据制度的构想[D].辽宁师范大学,科学社会主义与国际共产主义运动,2003,硕士.
[44]陶军宏,李小年,江大好.镍基催化剂对衣康酸连续化催化加氢研究[J].化工生产与技术,2014,02:15-18+66.
[45]周阳.海洋定点监测升降式浮标控制系统研制[D].杭州电子科技大学,电路与系统,2013,硕士.
[46]荣隽.计算机音乐音频制作中的虚拟声场效果研究[D].南京艺术学院,2004,硕士.
[47]刘中阳.β-catenin、APC在膀胱移行细胞癌中的表达及其临床意义[D].郑州大学,外科学,2013,硕士.
[48]谈述战,王梦媚,葛传良,刘毅,王德禧.石墨烯产业化制备技术及其应用研究进展[J].工程塑料应用,2013,08:120-124.
[49]钱安川.把握需求变化——单元测试之道Java版[J].程序员,2005,06:126-127.
[50]张煜东,吴乐南,韦耿,吴含前,郭永亮.基于自适应蚁群算法的软硬件划分[J].控制与决策,2009,09:1385-1389.