miRNA-145在胆囊癌发病过程中的调控作用及机制研究

【摘要】第一章正常胆囊上皮细胞及胆囊癌细胞miRNA差异表达谱的建立目的：通过miRNA芯片技术比较正常胆囊上皮细胞与胆囊癌细胞GBC-SDmiRNA的差异表达谱。方法：培养正常胆囊上皮细胞及胆囊癌细胞GBC-SD,提取细胞总RNA,制作完成芯片,用LuxScan10KA双通道激光扫描仪进行芯片扫描,采用LuxScan3.0图像分析软件对芯片图像进行分析,对差异表达的miRNA进行筛选。选定miRNA-145作为研究对象,收集胆囊癌及癌旁新鲜组织标本各15例,提取组织总RNA,应用Real-timePCR检测其表达情况。结果：通过比对,成功建立了正常胆囊上皮细胞与胆囊癌细胞miRNA芯片,筛选出了150个差异表达miRNA,其中在胆囊癌细胞中表达上调的miRNA是89个,下调的是61个。选定miRNA-145作为研究对象,通过检测证实在胆囊癌组织中miRNA-145表达也下调。结论：1.通过miRNA芯片技术,在离体培养的正常胆囊上皮细胞及胆囊癌细胞中筛选出了150个差异表达miRNA,其中上调的miRNA是89个,下调的是61个。2.miRNA-145在离体培养的胆囊癌细胞GBC-SD及胆囊癌组织中表达均下调。第二章hsa-miRNA-145在胆囊癌细胞系GBC-SD中的生物学功能目的：在胆囊癌细胞GBC-SD中过表达miRNA-145,研究过表达miRNA-145对胆囊癌细胞体外增殖、侵袭、凋亡的影响。方法：构建miR-hsa-miRNA-145表达载体,转染胆囊癌细胞GBC-SD并收集转染后的GBC-SD细胞,设立转染空载组及空白对照组,用MTT法和克隆形成实验检测各组细胞增殖情况,并采用流式细胞仪测定细胞周期分布及细胞凋亡情况。分别提取转染组及对照组细胞总蛋白,用Westernblot法检测两组细胞中凋亡相关蛋白caspase3蛋白表达量的变化。另外通过制备Transwell小室检测细胞侵袭能力。结果：1.成功构建hsa-miRNA-145过表达载体。2.通过MTT检测及克隆形成实验,我们发现在细胞培养第4天,稳定转染hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞与转染空载组及对照组相比,就表现出30%的细胞生长抑制(P<0.05)。另外我们选取了2000个瞬时转染hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞与对照组细胞分别进行了克隆形成能力检测,发现瞬时转染hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞克隆形成的数量远远少于对照组(P<0.01)。3.应用流式细胞仪进行检测发现对照组细胞G1期、S期分布分别为45.16%、31.93%,而hsa-miRNA-145过表达细胞G1期、S期分布分别为53.83%、46.17%,DNA合成期hsa-miRNA-145过表达细胞含量较对照组略有上升。同时发现转染hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞中AnnexinV与PI双阳性的凋亡细胞数量远多于对照组。4.过表达miRNA-145的GBC-SD细胞,其凋亡相关蛋白caspase3表达量较对照组显著升高。5.在Transwell小室实验中,过表达hsa-miRNA-145的GBC-SD细胞与对照组细胞相比,穿过培养小室底部的细胞数量明显减少。结论：1.过表达miRNA-145抑制胆囊癌细胞GBC-SD生长、侵袭能力。2.过表达miRNA-145对GBC-SD细胞周期无影响。3.过表达]miRNA-145诱导GBC-SD细胞凋亡。第三章miRNA-145在调节胆囊癌细胞系功能中的靶基因探究目的：探讨miRNA-145在调节胆囊癌细胞系功能中的可能靶基因。方法：通过我们的前述研究结果发现miRNA-145对胆囊癌细胞系凋亡的调控作用明显,从而预测DFF-45为miRNA-145可能靶基因,我们拟通过双荧光素酶报告系统对其做出验证。另外我们采用Real-timePCR法和、Westernblot法分别检测过表达miRNA-145在胆囊癌GBC-SD细胞和正常胆囊GBC-SD细胞中DFF45mRNA和蛋白的表达变化。结果：Real-timePCR表明过表达miRNA-145细胞系中,与空白对照组相比DFF45的转录水平显著下调(p<0.05),差异具有统计学意义。过表达miRNA-145细胞系中,与空白对照组与空转质粒组相比DFF45的蛋白水平显著降低(p<0.01)。利用双荧光素酶报告系统验证了DFF45是miRNA-145的靶基因。结论：1.在胆囊癌GBC-SD细胞中过表达miRNA-145导致DFF45表达下降。2.miRNA-145靶向DFF45mRNA中CDS854位点,抑制DFF45的翻译。第四章胆囊腺癌组织中DFF45表达及临床病理意义目的：研究胆囊良恶性病变组织中DFF45表达水平及其临床病理意义。方法：108例胆囊腺癌、46例癌旁组织、15例腺瘤性息肉和35例慢性胆囊炎手术切除标本常规制作石蜡包埋切片,DFF45染色方法为EnVision免疫组化法。结果：胆囊腺癌DFF45表达阳性率明显高于癌旁组织(Χ2=6.92,P<0.01)、腺瘤性息肉(Χ2=4.49,P<0.05)和慢性胆囊炎(Χ2=12.98,P<0.01)。高分化、无淋巴结转移、未侵犯周围组织的病例DFF45表达阳性率明显高于低分化、淋巴结转移和侵犯周围组织的病例(P<0.05或P<0.01)。经Kaplan-Meier生存分析发现DFF45表达阳性病例术后生存期高于阴性表达病例(P=0.025)。Cox多变量回归分析显示DFF45阴性表达是反映胆囊腺癌预后不良的危险因素。结论：DFF45表达与胆囊腺癌临床生物学行为及预后密切相关,DFF45阴性表达者预后不良。图26幅,表8个,参考文献120篇。
【作者】袁源；
【导师】杨竹林；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】胆囊癌；miRNA芯片；real-timePCR；miRNA-145；Westernblot；MTT；流式细胞；克隆形成实验；双荧光素酶报告系统；靶基因；DFF45；胆囊肿瘤；胆囊息肉；慢性胆囊炎；DNA裂解因子45；免疫组织化学；

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