miR-125b抑制骨肉瘤增殖及转移的作用及其可能的信号机制研究

【摘要】目的：检测miR-125b在骨肉瘤组织及骨肉瘤细胞系中的表达水平,研究miR-125b在骨肉瘤细胞中的细胞生物学作用；通过生物信息学预测并验证其可能参与调控的信号通路,探索其在骨肉瘤发生发展中可能的分子作用机制。方法：1、QPCR技术检测15例骨肉瘤组织标本及配对的癌旁组织标本,以及骨肉瘤细胞系MG63、Saos-2,U2os和作为对照的人胚肾细胞中miR-125b的表达水平；2、化学合成miR-125b核酸和miR-125b反义核酸转染转染至MG63和Saos-2骨肉瘤细胞系,Transwell实验检测miR-125b过表达和沉默对MG63和Saos-2骨肉瘤细胞侵袭能力的影响；化学合成miR-125b核酸和miR-125b反义核酸转染至MG63和Saos-2骨肉瘤细胞系,CCK8实验检测miR-125b过表达和沉默对MG63和Saos-2骨肉瘤细胞增殖能力的影响；3、采用裸鼠荷瘤实验体内观察过表达miR-125b对骨肉瘤细胞Saos-2在小鼠体内的成瘤能力影响；4、利用生物信息学软件对miR-125b进行靶基因的预测分析,筛选出miR-125b参与MARK信号通路的潜在靶基因；5、QPCR及Westernblot实验检测MG-63细胞中miR-125b过表达及沉默状态下MARK信号通路中上游基因MKK7mRNA及蛋白表达水平；6、采用miR-125b过表达质粒,miR-125b过表达对照质粒,miR-125b沉默质粒,miR-125b沉默对照质粒与包含MKK73’UTR区域序列的双荧光素酶报告系统质粒pEZX-MT05转染到MG-63细胞,检测不同组的荧光素酶活性,判断骨肉瘤细胞中miR-125b与MKK73’UTR区域的特异性结合。结果：1、miR-125b在骨肉瘤组织及细胞系中均低表达；2、过表达miR-125b水平抑制MG63和Saos-2骨肉瘤细胞的迁移能力而沉默miR-125b能增加MG63和Saos-2骨肉瘤细胞的迁移能力；过表达miR-125b水平抑制MG63和Saos-2骨肉瘤细胞的增殖而抑制miR-125b表达水平可以促进MG63和Saos-2骨肉瘤细胞的增殖；3、过表达miR-125b水平可以明显抑制Saos-2骨肉瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力；4、生物信息学预测发现miRNA125b对MAPK信号通路上游8个基因可能存在靶向调控作用,其中MKK7的3’UTR区具有能够与miR-125b结合的高度保守序列；5、沉默miRNA125b表达,MEKK7的mRNA和蛋白表达量上升,而过表达niR-125b,MKK7的mRNA和蛋白表达量下降；6、与对照组相比,miR-125b过表达质粒组荧光素酶活性明显下降,而miRNA-125b沉默质粒组荧光素酶活性明显升高。结论：1、miR-125b在骨肉瘤组织和骨肉瘤细胞系中均低表达；2、miR-125b过表达不仅可以在体外抑制骨肉瘤细胞的增殖,迁移,还可以抑制骨肉瘤细胞在小鼠体内的成瘤能力；3、推论MKK7可能是骨肉瘤细胞中miR-125b参与MAPK信号通路的潜在靶向调控基因。
【作者】刘立宏；
【导师】肖涛；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】miR-125b；MAPK信号通路；MKK7；骨肉瘤；

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