雌二醇通过Wnt/β-catenin信号通路调节成骨细胞增殖的作用机制研究

【摘要】研究背景青少年特发性脊柱侧凸(AdolescentIdiopathicScoliosisAIS)是一种比较常见的脊柱畸形,至今发病机制不明。既往流行病学研究发现,AIS好发于青少年女性患者。随着基因组测序广泛应用,更多专家开始关注从遗传学角度寻找AIS病因。近年来Inoue,WuJ等在大样本量AIS患者中进行遗传筛查,发现雌激素受体基因多态性与AIS侧凸的进展存在关联性。我科在102例AIS患者中进行ERβ基因测序发现AIS与ERβ第五外显子多态性相关。在青春期雌性小鼠体内雌激素水平增高,雌激素通过ERα促进成骨纵向生长,同时也可加速内皮质骨骨沉积,削弱椎体大小及负重能力；另外雌激素通过激活雌激素受体ERβ抑制骨膜形成及骨骼线性生长,有可能使得椎体后柱生长减缓。两方面因素有可能引起椎体不对称生长,从而导致AIS的发生。我们在前期ERβ与青春期椎体线性生长之间关系的研究中发现,ERβRNAi干扰后,小鼠成骨细胞增殖率增加,细胞周期G1期明显改变。而CyclinD1是细胞周期G1期关键调控蛋白,且又是经典Wnt通路β-catenin下游靶基因。Wnt通路相关蛋白通过多条通路调节多种骨细胞生长,分化以及细胞死亡。本研究旨在从细胞水平探求雌激素及其受体与经典Wnt信号通路之间的联系。为以后研究经典Wnt通路在青春期小鼠椎体线性生长中作用提供依据。第一章雌激素促进小鼠成骨细胞前体细胞增殖能力目的观察不同浓度雌二醇E2对小鼠成骨细胞前体细胞Mc3T3-E1增殖影响并检测雌激素受体及CyclinD1表达。方法不同浓度(DMSO,10-9,10-8,10-7,10-6M)E2处理Mc3T3-E1细胞1,3,5,7,9天,MTT法检测成骨细胞增殖率,绘制生长曲线,分析最佳增殖率时浓度及时间。并以最佳浓度处理Mc3T3-E1细胞3天,碘化丙啶PI染色流式细胞术检测细胞周期,Real-timePCR检测细胞雌激素受体及CyclinD1m(NA表达。结果E2促进小鼠成骨细胞增殖。MTT结果显示10-7M浓度雌二醇作用细胞5天后细胞能获得最佳增殖率。PI染色流式细胞仪检测结果显示,E2作用后成骨细胞G0/G1细胞周期百分比下降,S期增加,Real-timePCR结果显示Mc3T3-E1细胞ERβ,ERβ及CylinD1表达增高。结论雌二醇促进小鼠成骨细胞增殖,促进雌激素受体ERα,ERβ及CyclinD1mRNA表达。第二章雌激素调控Wnt/β-catenin信号通路促进成骨细胞增殖目的观察雌二醇处理后Mc3T3-E1细胞内经典Wnt通路关键信号分子表达。方法不同浓度(DMSO,10-9,10-8,10-,10-6M)E2处理Mc3T3-E1细胞120min,westernblot检测经典Wnt通路中β-catenin,Gsk3β,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1的表达；免疫荧光检测β-catenin入核情况。并用Wnt3a和β-catenin抑制剂(xav939)分别处理Mc3T3-E1细胞作对照重复检测β-catenin,Gsk3β,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1表达及β-catenin核定位,MTT法检测药物处理后成骨细胞增殖能力,绘制细胞生长曲线。结果Westernblot结果E2促进经典Wnt通路中β-catenin,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1的表达,免疫荧光显示E2处理后Mc3T3-E1细胞β-catenin核定位增加。不同药物处理后Mc3T3-E1细胞westernblot显示雌二醇激活经典Wnt通路MTT结果同样也反应雌二醇通过激活经典Wnt通路促进小鼠成骨细胞增殖。结论雌二醇可激活经典Wnt通路促进小鼠成骨细胞增殖。第三章雌激素经ERa介导Wnt/p-catenin信号通路调控成骨细胞增殖目的检测小鼠成骨细胞内雌激素及其受体与经典Wnt通路之间关系。方法利用Plentilox3.7质粒构建雌激素受体ERα,ERβsiRNA干扰质粒,应用293FT慢病毒包装细胞,制备ERα,ERβsiRNA病毒,以不同ER干扰病毒感染Mc3T3-E1细胞24h,再E2处理Mc3T3-E1细胞120min,westernblot检测雌激素受体及β-catenin,Gsk3β,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1的表达；MTT检测不同ER干扰后成骨细胞细胞生长曲线。结果通过重组质粒酶切,测序鉴定成功构建Plentilox3.7-ERsRNAi。并以293FT细胞包装干扰病毒。Westernblot结果显示ERα干扰组合ERα,β联合干扰组β-catenin,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1的表达下降。其中联合干扰后下降更明显。ERβ干扰后细胞β-catenin,p-Gsk3β(Ser9)以及CyclinD1的表达相对于空白对照表达稍增强。MTT结果显示成骨细胞增殖率ERαERβ联合干扰组低于ERβ干扰组,ERβ干扰组细胞增殖率较空白组稍增加。结论雌二醇可通过雌激素受体ERα调节经典Wnt通路促进小鼠成骨细胞增殖。
【作者】黄佳；
【导师】张宏其；
【作者基本信息】中南大学，外科学，2014，博士
【关键词】雌二醇；小鼠成骨细胞前体细胞；CyclinD1；细胞增殖；Wnt信号通路；β-catenin；雌激素受体；

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