RKIP/miR-98在胶质瘤生长转移机制中的作用研究

【摘要】目的：胶质瘤是最常见的脑内原发性的肿瘤,其发病率在所有颅内肿瘤中居第一位。其中,IV型胶质瘤的恶性程度最强。尽管目前临床上普遍开展了手术、放疗、化疗等多种治疗方法,但胶质瘤患者的预后仍然较差,其5年生存率大约10%。由于IV型胶质瘤的侵袭性很强,对现有化疗药物普遍存在耐药性,所以迫切需要更多的研究来优化治疗手段。探索胶质瘤发生、发展的新治疗靶点,可能为提高胶质瘤的临床治疗效果带来希望。有研究表明,RAS/RAF信号通路在胶质瘤的发生、发展中起到重要的作用。其中,Raf-1激酶抑制蛋白(Raf-1kinaseinhibitorprotein,RKIP)属于磷脂酰乙醇胺家族的一员,参与调控恶性肿瘤。有研究发现,RKIP能通过抑制Raf-1-MEK1/2-ERK1/2和NF-κB信号通路的活性,从而抵消这两条信号通路促生存、抗凋亡的作用,最终抑制肿瘤细胞的生长。过表达RKIP可以增强肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。然而,RKIP在胶质瘤中的作用及相关机制,目前尚不清楚。MicroRNA是一类长度大约为19-25个核糖核酸的小分子RNA,自从1998年在线虫上首次发现后,其表达和功能逐渐被广为关注。MicroRNA并不编码蛋白,而是通过直接结合其靶基因nRNA的3’-非翻译区内的结合位点,抑制mRNA的翻译或诱导其降解,因此可在转录后水平抑制基因的表达。近年来,microRNA在恶性胶质瘤中潜在的诊断和治疗作用吸引了越来越多的关注。诸多研究表明,microRNA参与调控胶质瘤细胞的生存、凋亡、增殖、细胞周期进展、迁移、侵袭和血管生成等生物学过程。另外,胶质瘤组织和对应的癌旁组织中,microRNA表达存在明显的差异,提示microRNA有可能作为诊断胶质瘤的重要工具。最近有研究发现,microRNA-98很可能在包括前列腺癌、鳞状细胞癌、肺癌等多种恶性肿瘤的发生、发展、耐药性中发挥了重要的调控作用,然而,其在胶质瘤中的作用尚未见报道。本研究发现HMGA2是microRNA-98的靶基因。HMGA2是高迁移率蛋白家族A(high-mobilitygroupA)的一员,能通过影响转录因子的活性参与调控肿瘤细胞的上皮间质转化,从而参与肿瘤的转移。然而,HMGA2在胶质瘤细胞中的作用尚不明确。本课题旨在探明RKIP在胶质瘤的转移中所发挥的作用可能与microRNA-98调控的HMGA2密切相关。首先我们收集了26例胶质瘤标本,对RKIP在胶质瘤组织中的表达进行了检测,发现其表达显著下调,提示其在胶质瘤中可能起到重要作用。之后,我们进一步研究了RKIP与microRNA-98在胶质瘤中的关系,以及microRNA-98与HMGA2的靶向关系。方法：收集26例不同级别的胶质瘤组织以及胶质瘤细胞株U251,U87,SHG44,以癌旁组织或胶质细胞HEB为对照,分别利用Real-timePCR和WesternBlotting检测RKIP、microRNA-98和HMGA2在正常胶质细胞、胶质瘤细胞株和胶质瘤组织中的表达水平。(1)利用双荧光素酶报告系统验证microRNA-98与HMGA2的靶向调控关系。(2)在胶质瘤细胞U87、U251细胞中,利用慢病毒过表达RKIP,用WesternBlotting验证转染效率后,利用Real-timePCR检测microRNA-98的表达水平,用WesternBlotting检测HMGA2的表达水平。(3)在胶质瘤细胞U87、U251细胞中,过表达RKIP后,用BrdU检测U87、U251细胞增殖能力的改变。(4)在胶质瘤细胞U87、U251细胞中,过表达RKIP后,用Transwell检测U87、U251细胞侵袭能力的改变。(5)利用]microRNA-98mimic转染胶质瘤细胞U87和U251细胞,利用Real-timePCR检测转染效率；同时过表达RKIP,利用Real-timePCR检测nicroRNA-98的表达水平。(6)设置分组：对照组、过表达RKIP组、microRNA-98+RKIP共转组,用WesternBlotting检测HMGA2的表达。(7)设置分组：对照组、过表达microRNA-98组、过表达RKIP组、microRNA-98+RKIP共转组。用BrdU检测U87、U251细胞增殖能力的改变；用Transwell检测U87、U251细胞侵袭能力的改变。结果：(1)与癌旁组织相比,胶质瘤组织中RKIP和microRNA-98的表达水平显著降低,而HMGA2的表达水平则显著升高。其中,microRNA-98和RKIP具有显著的正相关关系,而microRNA-98与HMGA2的表达呈负相关关系。(2)与正常胶质细胞HEB相比,胶质瘤细胞系SHG44、U251、U87中RKIP和microRNA-98的表达水平显著降低,而HMGA2的表达水平则显著升高,尤其在U251、U87细胞中差异最为明显。(3)双荧光素酶报告检测发现,microRNA-98可以直接结合HMGA2mRNA的3’-UTR区。(4)在胶质瘤细胞U87、U251细胞中,过表达RKIP后,microRNA-98的表达显著上调,而HMGA2的表达则显著降低,细胞增殖无明显改变,而侵袭能力下降。(5)与单独转染microRNA-98mimic相比,共转染microRNA-98+RKIP后,U87、U251细胞中microRNA-98的表达水平进一步升高。(6)与单独转染RKIP相比,共转染microRNA-98+RKIP后,U87、U251细胞中HMGA2的表达进一步降低。(7)与单独转染RKIP或microRNA-98相比,共转染microRNA-98+RKIP后,并未显著影响U87、U251细胞的增殖水平。(8)与单独转染RKIP或nicroRNA-98相比,共转染microRNA-98+RKIP后,U87、U251细胞侵袭能力进一步减弱。结论：(1)RKIP与nicroRNA-98在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中表达显著降低。(2)RKIP与nicroRNA-98在胶质瘤组织中的表达呈正相关关系。(3)过表达RKIP可上调microRNA-98的表达,对细胞的增殖无明显影响,但可抑制胶质瘤细胞的转移。(4)HMGA2在胶质瘤组织和和胶质瘤细胞系中表达显著升局。(5)HMGA2与microRNA-98在胶质瘤组织中的表达呈负相关关系。(6)microRNA-98靶向调控HMGA2的表达。(7)RKIP可能通过促进microRNA-98的表达,抑制HMGA2的表达,进而抑制胶质瘤细胞的侵袭。(8)RKIP/microRNA-98/HMGA2通路可能作为治疗恶性胶质瘤的一个重要靶点。
【作者】陈梓桂；
【导师】姜冰；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】胶质瘤细胞；RKIP/miR-98；microRNA；胶质瘤组织；细胞调亡；胶母细胞瘤；细胞增殖能力；恶性胶质瘤；肿瘤干细胞；信号通路；

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