Cathepsin V参与HMGB1促进血管新生作用

【摘要】目的：探讨HMGB1促进人脐静脉内皮细胞血管新生的作用机制以及内源性蛋白酶对其促血管新生作用的调控。方法：采用内皮细胞成管功能分析不同干预药物对内皮细胞成管功能的促进或抑制作用。采用蛋白质印记法检测细胞内外蛋白水平的变化。采用细胞免疫荧光染色法检测细胞内蛋白水平及细胞膜表面受体水平。采用重组HMGB1、蛋白酶抑制剂SID26681509、HMGB1-TLR4/MD2抑制剂Tetramer、TLR4抑制剂viper、Erk磷酸化抑制剂U0126、沙奎那韦等药物干预人脐静脉内皮细胞以评价内皮细胞成管功能及细胞蛋白表达变化。通过药物刺激和siRNA干扰的方法研究基因及蛋白作用：(1)应用蛋白酶抑制剂SID抑制蛋白酶cathepsinV的作用：(2)应用Tetramer抑制HMGB1-TLR4特异性信号转导：(3)应用viper抑制与TLR4有关的信号转导；(4)应用U0126抑制细胞内Erk磷酸化过程；(5)应用siRNA干扰细胞内HMGB1等蛋白的表达。结果：研究发现缺氧过程中内皮细胞核内的HMGB1大量移位、释放到细胞外。rHMGB1(1μ/ml)促进内皮细胞成管功能,siRNA干扰HMGB1表达后,内皮细胞成管功能下降。rHMGB1促进内皮细胞ERK磷酸化,且其作用呈现双相,即短时效应(30分钟内)和长时效应(3小时以上)。ERK磷酸化抑制剂U0126抑制内皮细胞的成管功能。rHMGB1刺激后的内皮细胞表面TLR4表达增加。TLR4抑制剂Viper可以抑制内皮细胞的成管功能及ERK磷酸化。HMGB1-TLR4/MD2作用的特异性抑制剂Tetramer同样能抑制内皮细胞的成管功能及ERK磷酸化。Viper及Tetramer均能抑制rHMGB1与内皮细胞的结合。缺氧环境下,内皮细胞中的CathepsinV释放到细胞外,且rHMGBl刺激时其释放增加。HMGB1-TLR4/MD2特异性抑制剂Tetramer及ERK磷酸化抑制剂U0126均可抑制CathepsinV的释放。CathepsinV的抑制剂SID抑制内皮细胞成管及HMGB1诱导的内皮成管及ERK磷酸化,但并不影响rHMGB1与内皮细胞的结合。Saquinavir抑制内皮细胞成管。在不同的时间点(6h,12h,24h),Saquinavir能够抑制CathepsinV的释放。类似于SID,Saquinavir能抑制内皮细胞ERK磷酸化过程但不抑制rHMGB1与内皮细胞的结合。结论：缺氧环境下内皮细胞释放HMGB1,通过TLR4通路激活ERK磷酸化促进血管新生；内皮细胞同时释放CathepsinV参与HMGB1信号转导过程；Saquinavir具有类似CathepsinV抑制剂的作用,抑制HMGB1相关的内皮成管功能。
【作者】刘红；
【导师】袁洪；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】HMGB1；cathepsinV；ERK磷酸化；内皮细胞；血管新生；

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