MicroRNA-34b-5p调控发育期惊厥后海马星形胶质细胞凋亡及其机制的研究

【摘要】第一部分发育期惊厥性脑损伤后海马miRNA差异表达谱分析目的筛选发育期惊厥性脑损伤后海马差异表达的miRNAs,为进一步探讨miRNA在发育期惊厥性脑损伤发生机制中的作用提供依据。方法健康清洁20日龄SD大鼠16只,随机分为正常对照组和惊厥组,每组8只大鼠。三氟乙醚反复吸入(每天一次,连续6天)制作发育期惊厥模型,对照组除不吸入三氟乙醚外,其他处理同惊厥组。反复惊厥后1d大鼠断头取脑,分离海马组织,提取总RNA进行逆转录,TaqMan(?)MicroRNAArray方法筛选出惊厥组与对照组大鼠海马差异表达的miRNAs,并利用实时定量PCR对部分差异表达的miRNAs进行二次验证。结果TaqMan(?)MicroRNAArray检测发现有30个miRNAs在惊厥组和对照组海马组织中表达差异显著,差异倍数大于2倍以上。其中9个miRNAs上调,21个miRNAs下调。上调显著的miRNAs有：miR-34b-5p、miR-204等；下调显著的有miR-582-3p,miR-672等。实时定量PCR对差异表达的miR-34b-5p、miR-204、miR-582-3p、miR-672进行验证,结果与TaqMan低密度芯片结果趋势一致,表明芯片结果可靠,提示miR-34b-5p、miR-204等miRNAs参与了发育期惊厥性脑损伤的发生过程。结论MiR-34b-5p、miR-204等部分miRNAs在发育期惊厥组和正常对照海马组织中存在显著差异表达,提示它们可能参与了发育期惊厥性脑损伤发生的分子机制。第二部分MicroRNA-34b-5p及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bag、Caspase-3在惊厥后海马的动态表达及意义目的研究发育期大鼠反复惊厥后海马组织miR-34b-5p及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3的动态表达变化,探讨miR-34b-5p在发育期惊厥性脑损伤后海马神经细胞凋亡中的作用。方法96只20日龄健康Sprague-Dawley(SD)大鼠随机分为2组：正常对照组和惊厥组。通过三氟乙醚反复吸入(连续6次,每天1次)制作发育期大鼠惊厥动物模型。用qRT-PCR方法检测反复惊厥后2h、6h、Id、3d、7d海马组织中miR-34b-5p的表达；WesternBlot方法检测海马组织中Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达。结果(1)实时定量PCR结果显示,反复惊厥后2h-1d海马miR-34b-5p的表达均较对照组显著增高(P<0.01),3d、7d时逐渐恢复至正常水平(P>0.05)。(2)Westernblot结果显示,反复惊厥后2h大鼠海马Bcl-2蛋白水平与对照组相比无显著变化(P>0.05),6h较对照组显著降低,1d时进一步下调,7d时下降最显著(P<0.01)；而反复惊厥后Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表达呈现相反的趋势,反复惊厥后2h大鼠海马Bax、Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白水平较对照组显著升高,6h表达量更高,1d时升高最明显,3d、7d时仍显著高于对照组(P<0.01);Bax/Bcl-2的比值在反复惊厥后各时间点皆显著高于对照组(P<0.01)。结论反复惊厥后早期海马miR-34b-5p的表达显著增强,同时伴有促凋亡相关基因Bax,Caspase-3活性蛋白的表达增强,Bax/Bcl-2的比值升高,而抗凋亡基因Bcl-2蛋白的表达降低,提示miR-34b-5p可能在发育期惊厥性脑损伤后早期神经细胞凋亡中发挥重要作用。第三部分MicroRNA-34b-5p的靶基因预测及验证目的预测并验证miR-34b-5p作用的靶基因,进一步了解miR-34b-5p的生物学功能及在发育期惊厥性脑损伤中的作用机制。方法利用靶基因预测软件分析得到miR-34b-5p作用的靶基因。构建野生型靶基因3’-UTR和变型靶基因3’-UTR荧光素酶报告基因载体,将这两个载体分别与miR-34b-5pmimics或miR-34b-5p阴性载体(miR-34b-5pmNC)共同转染海马星形胶质细胞,双荧光素酶报告基因分析检测荧光素酶活性变化以证实该靶基因是否为miR-34b-5p作用的靶基因。结果(1)软件预测Bcl-2基因为miR-34b-5p作用的靶基因。(2)与转染miR-34b-5pmNC相比,共转染miR-34b-5pmimics和野生型Bcl-23’-UTR的荧光素酶活性显著下降,而转染突变型Bcl-23’-UTR的荧光素酶活性则无明显变化,证实Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。结论成功构建了野生型和突变型Bcl-23’-UTR荧光素酶报告基因载体；软件预测并经荧光素酶报告基因检测证实Bcl-2基因是miR-34b-5p直接作用的靶基因。第四部分MicroRNA-34b-5p对惊厥后海马星形胶质细胞凋亡的影响及其机制目的研究miR-34b-5p对惊厥后海马星形胶质细胞凋亡的影响,阐明miR-34b-5p调控惊厥后海马星形胶质细胞凋亡的可能机制。方法(1)原代分离培养大鼠海马星形胶质细胞,以海人酸干预诱导细胞惊厥。应用TUNEL染色检测不同浓度海人酸对海马星形胶质细胞凋亡的影响,确定后续实验海人酸处理用浓度。并以实时定量PCR检测海人酸干预后海马星形胶质细胞miR-34b-5p表达水平的改变,WesternBlot检测凋亡相关基因Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白表达水平的改变。(2)利用脂质体将miR-34b-5p模拟物(miR-34b-5pmimics)、miR-34b-5p抑制剂(miR-34b-5pinhibitors)以及相对应的阴性对照(miR-34b-5pmNC、miR-34b-5piNC)瞬时转染海马星形胶质细胞,实时定量PCR检测转染前后miR-34b-5p的表达。并检测海人酸诱导惊厥后海马星形胶质细胞凋亡及凋亡相关指标的变化。Bcl-2mRNA的表达用实时定量PCR检测：海马星形胶质细胞的凋亡用TUNEL染色进行检测；凋亡相关指标Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的表达用WesternBlot检测。(3)分别将controlsiRNA、Bcl-2siRNA、miR-34b-5pinhibitors以及Bcl-2siRNA+miR-34b-5pinhibitors转染海马星形胶质细胞,并用海人酸进行干预,WesternBlot检测Bcl-2沉默后对海马星形胶质细胞Caspase-3蛋白表达的影响。结果(1)海人酸诱导惊厥后海马星形胶质细胞凋亡显著增加,其miR-34b-5p表达水平显著上调而Bcl-2蛋白表达明显受到抑制；凋亡相关基因Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表达显著升高,Bax/Bcl-2的比值显著增加。(2)与空白对照及转染了miR-34b-5pmNC的海马星形胶质细胞相比,转染了miR-34b-5pmimics的海马星形胶质细胞中miR-34b-5p的表达显著增加,海马星形胶质细胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表达显著增加,而Bcl-2蛋白的表达显著降低；而转染了miR-34b-5pinhibitors的海马星形胶质细胞中]miR-34b-5p的表达显著降低,海马星形胶质细胞凋亡率、Bax/Bcl-2的比值、Bax及Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白表达显著降低,Bcl-2蛋白的表达则显著增加。(3)miR-34b-5p负性调节Bcl-2蛋白的表达,但对Bcl-2mRNA的表达无影响。(4)miR-34b-5pinhibitors显著降低Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表达,而Bcl-2siRNA和miR-34b-5pinhibitors共转染后Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的表达显著高于miR-34b-5pinhibitors组,表明Bcl-2siRNA的转染能阻断miR-34b-5pinhibitors导致的Caspase-3(19kD/17kD)活性蛋白的降低。结论(1)海人酸诱导海马星形胶质细胞凋亡过程中,miR-34b-5p表达显著增加。(2)成功构建了miR-34b-5p过表达和低表达细胞模型,过表达miR-34b-5p能够促进惊厥后海马星形胶质细胞凋亡,抑制miR-34b-5p的表达可以阻碍惊厥后海马星形胶质细胞凋亡。(3)miR-34b-5p通过在转录后水平抑制靶基因Bcl-2表达,从而促进Caspase-3活化,激活Caspase信号途径对惊厥后海马星形胶质细胞凋亡进行调控。
【作者】刘利群；
【导师】易著文；毛定安；
【作者基本信息】中南大学，临床医学，2014，博士
【关键词】发育期脑；惊厥；大鼠；miRNA表达谱；海马；脑发育；脑损伤；Bcl-2；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；靶基因；miR-34b-5p；载体；星形胶质细胞；凋亡；Caspase-3；

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