顺铂通过miR-376c/TGFA抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖的研究

【摘要】目的：DDP是广谱抗癌药,为铂的金属络合物,作用似烷化剂,主要作用靶点为DNA,属细胞周期非特异性药物,但由于大剂量化疗的毒副反应、肿瘤细胞的突变、原发或继发的化疗药物耐药、早期肺转移、局部复发等问题,导致近二十年来骨肉瘤患者的生存率无法继续显著提高。寻找一种新的有效、可行、副作用小的骨肉瘤治疗方法,将在很大程度上改变骨肉瘤患者的治疗现状。本课题拟研究DDP上调miR-376c下调TGFA抑制骨肉瘤细胞增殖的功能学效应,以期为寻找骨肉瘤的防治靶标提供坚实基础。方法：1、构建TGFAshRNA载体,脂质体转染Saos-2细胞,QPCR和Westernblot检测TGFA沉默效率；2、转染TGFA-shRNA,用MTT法和BrdU法检测Saos-2细胞的生长和细胞DNA的合成；3、DDP与TGFAORFclone联合处理Saos-2细胞,用MTT法和BrdU法检测Saos-2细胞的生长和细胞DNA的合成；4、化学合成miR-376cmimics和构建miR-376cSponge载体,用QPCR检测miR-376c的表达；5、DDP与miR-376c以及miR-376cSponge联合处理时,用MTT法和BrdU法检测Saos-2细胞的生长和细胞DNA的合成；6、用荧光素酶报告基因检测miR-376c与TGFA的靶向调控作用；7、DDP与miR-376cSponge联合处理Saos-2细胞,Westernblot检测PI3K/AKT通路活性；8、miR-376c与TGFA联合处理Saos-2细胞,Westernblot检测PI3K/AKT通路活性。结果：1、TGFA-shRNA转染Saos-2细胞,可沉默70%左右TGFA的表达；2、转染TGFAshRNA可显著抑制Saos-2细胞的生长与细胞DNA的合成；3、DDP浓度为2.5mg/L时,即可显著抑制TGFA的表达,DDP与TGFAORFclone联合处理Saos-2细胞时,可回复DDP对细胞增殖的抑制作用；4、miR-376cmimics可使miR-376c过表达约50倍,miR-376cSponge可下调miR-376c表达约70%；5、DDP与miR-376c联合处理细胞相较于DDP单独作用,可更加显著的抑制Saos-2细胞的增殖,DDP与miR-376cSponge联合处理细胞相较于DDP单独作用,可回复DDP对Saos-2细胞的抑制作用；6、miR-376c可与TGFA的3’UTR区直接相互作用而抑制TGFA的表达；7、DDP与miR-376cSponge联合处理Saos-2细胞相较于DDP单独作用,不可改变P13K和AKT总蛋白的表达,但可回复DDP对磷酸化P13K和磷酸化AKT表达抑制；8、miR-376c与TGFA联合处理Saos-2细胞相较于miR-376c单独作用,不可改变P13K和AKT总蛋白的表达,但可回复DDP对磷酸化P13K和磷酸化AKT表达抑制。结论：1、DDP可通过下调TGFA抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖；2、DDP可通过上调miR-376c抑制骨肉瘤Saos-2细胞增殖；3、在骨肉瘤Saos-2细胞中,miR-376c可靶向抑制TGFA的表达；4、DDP可通过下调TGFA抑制PI3K/AKT通路活性；5、miR-376c可通过靶向抑制TGFA抑制PI3K/AKT通路活性；6、DDP可通过miR-376c/TGFA途径抑制骨肉瘤细胞增殖。图41幅,表20个,参考
【作者】刘博；
【导师】彭丹；
【作者基本信息】中南大学，外科学，2014，博士
【关键词】顺铂；miR-376c；TGFA；增殖；PI3K/AKT；

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